HØY YTELSE VÆSKEKROMATOGRAFI (HPLC): BEGRUNNELSE, UTSTYR, TYPER - KJEMI - 2026

Den høye ytelsen væskekromatografi er en instrumentell teknikk brukt i kjemiske analyser som separate blandinger er tillatt, renser og kvantifiserer dets komponenter, og videre studier. Det er kjent med forkortelsen HPLC, avledet fra engelsk: High Performance Liquid Chromatography.

Som navnet antyder, fungerer det ved å manipulere væsker. Disse består av en blanding sammensatt av analytten eller prøven av interesse, og ett eller flere løsningsmidler som fungerer som mobilfasen; det vil si den som drar analytten gjennom alt HPLC-utstyret og kolonnen.

HPLC utstyr. Kilde: Dqwyy

HPLC er mye brukt av kvalitetsanalyselaboratorier i mange selskaper; som legemidler og mat. Den aktuelle analytikeren må forberede prøven, den mobile fasen, kontrollere temperaturen og andre parametere og plassere hetteglassene inne i hjulet eller karusellen for at utstyret skal utføre injeksjonene automatisk.

HPLC-utstyret er koblet til en datamaskin som de genererte kromatogrammene kan observeres, i tillegg til å starte analysene, kontrollere strømningshastigheten til den mobile fasen, programmere typen eluering (isokratisk eller gradient) og slå på detektorene (UV -Vis eller massespektrofotometer).

Basis

I motsetning til konvensjonell væskekromatografi, så som papir- eller silikagelfylt kolonnekromatografi, er HPLC ikke avhengig av tyngdekraften for væsken for å våte den stasjonære fasen. I stedet fungerer det med høytrykkspumper, som irrigerer mobilfasen eller elueringsmidlet gjennom kolonnen med større intensitet.

På denne måten er det ikke nødvendig å helle mobilfasen noen ganger gjennom kolonnen, men systemet gjør det kontinuerlig og med høyere strømningshastigheter.

Men effektiviteten til denne teknikken skyldes ikke bare denne detalj, men også de bittesmå fyllstoffpartiklene som utgjør den stasjonære fasen. Når det er mindre, er kontaktområdet med den mobile fasen større, så det vil samhandle bedre med analytten og molekylene vil skille seg mer.

Disse to egenskapene, pluss det faktum at teknikken tillater kobling av detektorer, gjør HPLC langt overlegen i forhold til tynnsjikt eller papirkromatografi. Separasjoner er mer effektive, den mobile fasen beveger seg bedre gjennom den stasjonære fasen, og kromatogrammer kan oppdage enhver feil i analysen.

Utstyr

Forenklet diagram over driften av et HPLC-utstyr. Kilde: Gabriel Bolívar.

Over er et forenklet diagram over hvordan et HPLC-utstyr fungerer. Løsningsmidlene er i hver sin beholder, anordnet med slanger slik at pumpen tar et lite volum av dem inn i utstyret; vi har dermed mobilfasen.

Den mobile fasen eller elueringsmidlet må først avgasses på en slik måte at boblene ikke påvirker separasjonen av analytmolekylene, som blandes med den mobile fasen når utstyret har foretatt injeksjonene.

Den kromatografiske søylen er plassert inne i en ovn som gjør det mulig å regulere temperaturen. For forskjellige prøver er det således tilstrekkelige temperaturer for å oppnå separasjoner med høy ytelse, så vel som en bred katalog med kolonner og typer fyllinger eller stasjonære faser for spesifikk analyse.

Den mobile fasen med den oppløste analytt kommer inn i kolonnen, og fra den elueres først molekylene som "føler" mindre affinitet for den stasjonære fasen, mens de som blir mer beholdt av den eluerer senere. Hvert eluerte molekyl genererer et signal som vises på kromatogrammet, hvor retensjonstiden for de separerte molekylene blir observert.

Og på den annen side havner mobilfasen etter å ha passert gjennom detektoren i en avfallsbeholder.

HPLC-typer

Det er mange typer HPLC, men blant alle de mest fremragende er de følgende fire.

Normal fase kromatografi

Normal fasekromatografi refererer til en der den stasjonære fasen har polar karakter, mens den mobile fasen er ikke-polær. Selv om det kalles normalt, er det faktisk det minste brukt, med omvendt fase den mest utbredte og effektive.

Omvendt fase kromatografi

Å være en invers fase, og nå er den stasjonære fasen apolar og den mobile fasen polar. Dette er spesielt nyttig i biokjemisk analyse, siden mange biomolekyler oppløses bedre i vann og i polare løsningsmidler.

Ionbytterkromatografi

I denne typen kromatografi beveger analytten seg med en positiv eller negativ ladning gjennom kolonnen og erstatter ionene den huser. Jo høyere ladning, desto høyere er retensjon, og det er derfor den er mye brukt til å skille ioniske komplekser av overgangsmetaller.

Størrelse eksklusjon kromatografi

Denne kromatografien, i stedet for å separere, er ansvarlig for rensing av den resulterende blanding. Som navnet antyder, skilles analytten ikke lenger avhengig av hvor nær den er relatert til den stasjonære fasen, men i henhold til dens størrelse og molekylmasser.

Mindre molekyler vil være mer tilbakeholdt enn store molekyler, siden de sistnevnte ikke er fanget mellom porene i polymersøylefyllingene.

applikasjoner

HPLC gir mulighet for både kvalitativ og kvantitativ analyse. Ved å sammenligne retensjonstider for kromatogrammet under visse betingelser, kan tilstedeværelsen av en spesiell forbindelse påvises. Slik tilstedeværelse kan være en indikasjon på sykdom, utroskap eller medisinbruk.

Derfor er det en datamaskindel av diagnostiske laboratorier. På samme måte finnes det i farmasøytisk industri, siden det tillater å verifisere produktets renhet, så vel som dets kvalitet med hensyn til oppløsningen i magesekken. Utgangsmaterialer blir også utsatt for HPLC for å rense dem og sikre bedre ytelse i medikamentsyntese.

HPLC gjør det mulig å analysere og separere komplekse blandinger av proteiner, aminosyrer, karbohydrater, lipider, porfyriner, terpenoider, og er egentlig et utmerket alternativ for å jobbe med planteekstrakter.

Og til slutt lar molekylær eksklusjonskromatografi deg velge polymerer i forskjellige størrelser, siden noen kan være mindre eller større enn andre. På denne måten oppnås produkter med lave eller høye gjennomsnittlige molekylmasser, noe som er en avgjørende faktor for deres egenskaper og fremtidige anvendelser eller syntese.

referanser

1. Day, R., & Underwood, A. (1989). Kvantitativ analytisk kjemi. (femte utg.). PEARSON Prentice Hall.
2. Bussi Juan. (2007). Høy ytelse væskekromatografi. . Gjenopprettet fra: fing.edu.uy
3. Wikipedia. (2019). Høy ytelse væskekromatografi. Gjenopprettet fra: en.wikipedia.org
4. Clark Jim. (2007). Flytende kromatografi med høy ytelse. Gjenopprettet fra: chemguide.co.uk
5. Matthew Barkovich. (05. desember 2019). Flytende kromatografi med høy ytelse. Kjemi LibreTexts. Gjenopprettet fra: chem.libretexts.org
6. Fastlege Thomas. (15. april 2013). High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - Metoder, fordeler og applikasjoner. Gjenopprettet fra: azom.com