ENDONUKLEASER: FUNKSJONER, TYPER OG EKSEMPLER - BIOLOGI - 2026

De endonukleaser som er enzymer som kutter fosfodiesterbindingene ligger innenfor den nukleotid-kjeden. Endonukleasebegrensningssteder er svært varierte. Noen av disse enzymene kutter DNA (deoksyribonukleinsyre, vårt genetiske materiale) nesten hvor som helst, det vil si at de er uspesifikke.

Derimot er det en annen gruppe endonukleaser som er veldig spesifikke i regionen eller sekvensen som skal spaltes. Denne gruppen av enzymer er kjent som restriksjonsenzymer, og de er veldig nyttige innen molekylærbiologi. I denne gruppen har vi de velkjente enzymer Bam HI, Eco RI og Alu I.

Endonukleaser kutter DNA internt.
Kilde: pixabay.com

I motsetning til endonukleaser, er det en annen type katalytiske proteiner - eksonukleaser - som er ansvarlige for å bryte fosfodiesterbindingene i enden av kjeden.

Restriksjon endonukleaser

Restriksjonsendonukleaser eller restriksjonsenzymer er katalytiske proteiner som er ansvarlige for spaltning av fosfodiesterbindinger inne i DNA-kjeden i veldig spesifikke sekvenser.

Disse enzymene kan kjøpes fra flere bioteknologiselskaper, og bruken av dem er nesten essensiell innenfor dagens DNA-manipulasjonsteknikker.

Restonstrasjonsendonukleaser blir navngitt ved å bruke de første bokstavene i det binomiske vitenskapelige navnet på organismen de kommer fra, etterfulgt av belastningen (dette er valgfritt) og slutter med gruppen av restriksjonsenzymer de tilhører. For eksempel er Bam HI og Eco RI mye brukt endonukleaser.

Regionen av DNA som enzymet gjenkjenner, kalles restriksjonssete og er unik for hver endonuklease, selv om flere enzymer kan falle sammen på restriksjonssetene. Dette stedet består generelt av en kort palindrom sekvens på omtrent 4 til 6 basepar i lengde, så som AGCT (for Alu I) og GAATTC for Eco RI.

Palindromiske sekvenser er sekvenser som, selv om de er lest i 5 'til 3' eller 3 'til 5' retning, er identiske. For tilfellet med Eco RI er den palindromiske sekvens for eksempel: GAATTC og CTTAAG.

Funksjoner og anvendelser av begrensningsendonukler

Heldigvis for molekylærbiologer har bakterier i løpet av evolusjonen utviklet en serie restriksjonsendonukleaser som internt fragmenterer genetisk materiale.

I naturen har disse enzymene utviklet seg - antagelig - som et bakterielt beskyttelsessystem mot invasjon av fremmede DNA-molekyler, for eksempel de fra fager.

For å skille mellom naturlig og fremmed genetisk materiale, kan disse restriksjonsendonukleasene gjenkjenne spesifikke nukleotidsekvenser. Dermed kan DNA som ikke har denne sekvensen være forstyrret inne i bakteriene.

I kontrast, når endonukleasen gjenkjenner restriksjonsstedet, binder den seg til DNAet og kutter det.

Biologer er interessert i å studere det genetiske materialet til levende ting. Imidlertid består DNA av flere millioner basepar i lengde. Disse molekylene er ekstremt lange og må analyseres i små fragmenter.

For å oppfylle dette målet, er restriksjonsendonukleaser integrert i forskjellige molekylærbiologiske protokoller. For eksempel kan et individuelt gen fanges opp og replikeres for fremtidig analyse. Denne prosessen kalles "kloning" av et gen.

Restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP)

Restriksjonsfragmentlengdepolymorfismer refererer til mønsteret av spesifikke nukleotidsekvenser i DNA som restriksjonsendonukleaser er i stand til å gjenkjenne og kutte.

Takket være enzymernes spesifisitet, er hver organisme preget av et spesifikt skjæremønster i DNAet, med opprinnelse av fragmenter med varierende lengde.

Typer restriksjon endonukleaser

Historisk sett har restriksjonsendonukleaser blitt klassifisert i tre typer enzymer, betegnet med romertall. Nylig er en fjerde type endonuklease blitt beskrevet.

Type I

Det viktigste kjennetegn ved endonukleaser av type I er at de er proteiner som består av flere underenheter. Hver av disse fungerer som et enkelt proteinkompleks og har vanligvis to underenheter kalt R, to M og en S.

S-delen er ansvarlig for gjenkjennelse av restriksjonssetet i DNA. R-underenheten er på sin side essensiell for spaltning og M er ansvarlig for å katalysere metyleringsreaksjonen.

Det er fire underkategorier av type I-enzymer, kjent med bokstavene A, B, C og D, som er i vanlig bruk. Denne klassifiseringen er basert på genetisk komplementering.

Type I-enzymer var de første restriksjonsendonukleasene som ble oppdaget og renset. Imidlertid er de mest nyttige innen molekylærbiologi type II, som vil bli beskrevet i neste avsnitt.

Type II

Endonukleaser av type II restriksjon gjenkjenner spesifikke DNA-sekvenser og spaltning i en konstant stilling nær en sekvens som produserer 5 'fosfater og 3' hydroksyler. De krever vanligvis magnesiumioner (Mg ²⁺ ) som kofaktorer , men det er noen som har mye mer spesifikke krav.

Strukturelt sett kan de vises som monomerer, dimerer eller til og med tetramere. Rekombinant teknologi bruker type II endonukleaser, og av denne grunn har mer enn 3.500 enzymer blitt karakterisert.

Type III

Disse enzymatiske systemene er sammensatt av to gener, kalt mod og res, som koder for underenhetene som gjenkjenner DNA og for modifikasjoner eller restriksjoner. Begge underenheter er nødvendige for begrensning, en prosess som er helt avhengig av ATP-hydrolyse.

For å spalte DNA-molekylet, må enzymet samvirke med to kopier av den ikke-palindromiske gjenkjenningssekvensen, og stedene må være i en omvendt retning på underlaget. Spaltning foregår av en DNA-translokasjon.

Type IV

En tilleggsgruppe er blitt identifisert i det siste. Systemet er sammensatt av to eller flere gener som koder for proteiner som spalter bare modifiserte DNA-sekvenser, enten metylert, hydroksymetylert eller hydrometylert glukosyl.

For eksempel gjenkjenner enzymet EckKMcrBC to dinukleotider med den generelle formen RmC; en purin etterfulgt av et metylert cytosin, som kan separeres med flere basepar - fra 40 til nesten 3000. Spaltingen finner sted omtrent 30 basepar etter stedet som enzymet kjenner seg igjen i.

Endonukleaser type V

Endonukleaser av denne typen er også kjent som "homing" endonukleaser. Disse enzymene gjenkjenner og kutter måls DNA-sekvensen på unike steder i genomet fra 14 til 40 bp.

Disse enzymene er ofte kodet i introner, og deres funksjon antas å være å fremme horisontal overføring av kuttede sekvenser. Etter kapping skjer en pausereparasjon i dobbelt-heliksen av DNA basert på den komplementære sekvensen.

eksempler

Endonuklease I fra E. coli fungerer som et forsvarssystem mot fag og parasitter. Den ligger hovedsakelig mellom den cytoplasmatiske membranen og celleveggen. Det produserer dobbeltstrengede brudd i det fremmede DNA som det samvirker i det periplasmatiske rommet.

CRISPR-Cas endonukleaser er enzymer som virker på forsvarsmekanismen for mange typer bakterier. Disse identifiserer og kutter spesifikke DNA-sekvenser fra invaderende organismer, som vanligvis er virus.

Nylig oppdaget forskere ved Massachusetts Institute of Technology (MIT) CRISPR-Cas12bm genomredigeringssystem med høy presisjon for modifisering av menneskelige celler.

referanser

1. Burrell, MM (red.). (1993). Enzymer av molekylærbiologi. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Type I-restriksjonsenzymer og deres pårørende. Nukleinsyrer forskning, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS, & Pfaller, MA (2017). Medisinsk mikrobiologi + StudentConsult på spansk + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriksjonsendonukleaser i analyse og restrukturering av DNA-molekyler. Årlig gjennomgang av biokjemi, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Type II restriksjon endonukleaser: struktur og mekanisme. Cellular and molecular life sciences, 62 (6), 685.