SPORFARGING: BEGRUNNELSE, TEKNIKKER OG BRUKSOMRÅDER - BIOLOGI - 2026

Den spore farging er metodene som brukes til å farge motstands strukturer som danner en viss bakterieslekter da under ugunstige betingelser; Disse strukturene tilsvarer en form for overlevelse.

Det er mange slekter som danner sporer; de viktigste er imidlertid Bacillus og Clostridium. Disse slektene anses som mer relevante fordi de har sykdomsfremkallende arter for mennesker.

Sporfarging etter Shaeffer - Fulton eller Wirtz-Conklin metoden. Og tambe (originalopplaster), fra Wikimedia Commons

Hver bacillus kan gi opphav til en spore. På tidspunktet for farging av preparatet kan sporen finnes i bacillus (endospore) eller utenfor den (exospore). Med konvensjonelle fargeteknikker for bakterier - som Gram-flekken, forblir sporer fargeløse.

For tiden er det flere fargemetoder som er i stand til å trenge gjennom den tykke strukturen i sporen for å farge den. Disse metodikkene er veldig varierte; Disse inkluderer Dorner-teknikken, Möeller-flekken og Shaeffer - Fulton-metodikken, også kjent som Wirtz-Conklin.

Av alle nevnte teknikker er Shaeffer-Fulton-metodikken den mest brukte i rutinelaboratorier. Den er oppkalt etter to mikrobiologer som skapte fargen i 1930: Alicia Shaeffer og MacDonald Fulton. Imidlertid er teknikken noen ganger kalt Wirtz-Conklin etter to bakteriologer fra 1900-tallet.

Basis

Sporene beis ikke med konvensjonelle flekker fordi de har en veldig tykk vegg. Sporenes komplekse sammensetning forhindrer inntreden av de fleste fargestoffer.

Hvis sporen studeres fra utsiden til innsiden, observeres følgende lag: først er det exosporium, som er det tynneste og ytre lag som er dannet av glykoproteiner.

Deretter kommer neglebåndet, som gir motstand mot høye temperaturer, etterfulgt av cortex sammensatt av peptidoglycan. Senere er veggen på basen som beskytter protoplasten.

Sporen er en dehydrert struktur som inneholder 15% kalsium og dipicolinsyre. Derfor er de fleste sporingsfargeteknikker avhengige av påføring av varme slik at fargestoffet kan trenge gjennom den tykke strukturen.

Når sporen er beiset, kan den ikke fjerne fargestoffet. I Shaeffer - Fulton-teknikken kommer malakittgrønt inn i vegetative celler, og når varme tilføres, trenger det inn i endosporen så vel som i eksosporene.

Ved å vaske med vann fjernes fargestoffet fra den vegetative cellen. Dette oppstår fordi det malakittgrønne fargestoffet er litt grunnleggende, så det binder svakt til den vegetative cellen.

I stedet kan den ikke komme ut av sporen og til slutt blir bacillusen forsynt med safranin. Dette grunnlaget gjelder for resten av teknikkene der noe lignende skjer.

Spore-fargingsteknikker

For å utføre sporefarging, må man oppnå en ren kultur av den mistenkelige stammen som skal studeres.

Kulturen blir utsatt for ekstreme temperaturer i 24 timer for å stimulere mikroorganismen til å sporulere. For dette kan kulturen plasseres i en ovn ved 44 ° C eller i kjøleskap (8 ° C) i 24 eller 48 timer.

Hvis det blir liggende for lenge ved de nevnte temperaturene, vil bare eksosporer observeres, siden alle endosporene allerede har forlatt bacillusen.

På slutten av tiden skal noen dråper steril fysiologisk løsning legges på et rent lysbilde. Så tas en liten del av kulturen og en fin spredning lages.

Etterpå lar den tørke, fikseres i varmen og farges med en av teknikkene som er forklart nedenfor:

Dorner teknikk

1- Tilbered i et reagensglass en konsentrert suspensjon av den sporulerte mikroorganismen i destillert vann og tilsett et like stort volum filtrert Kinyoun carbol fuchsin.

2- Plasser røret i et bad med kokende vann i mellom 5 og 10 minutter.

3- Bland en dråpe av den forrige suspensjonen på et rent lysbilde med en dråpe 10% vandig nigrosinoppløsning, kokt og filtrert.

4- Fordel og tørk raskt med svak varme.

5- Undersøk med et 100X mål (fordypning).

Sporene farger røde og bakteriecellene virker nesten fargeløse mot en mørkegrå bakgrunn.

Endret Dorner-teknikk

1- En suspensjon av den sporulerte mikroorganismen spres på et lysbilde og fikseres i varmen.

2- Prøven er dekket med en filterpapirstrimmel som det tilsettes carbol fuchsin. Fargestoffet varmes opp i 5 til 7 minutter med flammen til Bunsen-brenneren til det utvikles damp. Deretter fjernes papiret.

3- Preparatet vaskes med vann og tørkes deretter med absorberende papir.

4 - Dekk utstrykningen med en tynn film på 10% nigrosin, bruk et andre lysbilde for å spre nigrosin eller en nål.

Fargen tatt av sporer og bakterier er den samme som beskrevet i kjent teknikk.

Shaeffer - Fulton eller Wirtz-Conklin teknikk

1- Lag et fint utstryk med en suspensjon av den sporulerte mikroorganismen på en lysbilde og fest den til varme.

2- Dekk lysbildet med 5% malakittgrønn vandig løsning (du kan plassere et filterpapir på lysbildet).

3- Varm over flammen til Bunsen-brenneren for å forårsake frigjøring av damper og fjerne flammen. Gjenta operasjonen i 6 til 10 minutter. Hvis den malakittgrønne løsningen fordamper under prosedyren, kan mer tilsettes.

4- Fjern filterpapiret (hvis installert) og vask med vann.

5- Dekk lysbildet med 0,5% vandig safranin i 30 sekunder (noen varianter av teknikken bruker 0,1% vandig safranin og la det stå i 3 minutter).

Med denne teknikken vises sporene grønne og bacilliene røde.

Det har den ulempen at endosporene til unge kulturer ikke farger godt, siden de virker ekstremt klare eller fargeløse. For å unngå dette, anbefales det å bruke kulturer med 48 timers inkubasjon.

Möeller teknikk

1- Dekk utstrykningen med kloroform i 2 minutter.

2- Kast kloroformen.

3- Dekk til med 5% kromsyre i 5 minutter.

4 - Vask med destillert vann

5- Arket er dekket av carbol fuchsin-fenicada og blir utsatt for flammen til Bunsen-brenneren til utslipp av damper; så fjernes den fra flammen i noen øyeblikk. Operasjonen gjentas til 10 minutter er fullført.

6- Vask med vann.

7- Bruk surgjort etanol (saltsyre) for å misfarge. Det er igjen i 20 eller 30 sekunder.

8- Vask med destillert vann.

9- Kontraster ved å dekke arket med metylenblått i 5 minutter.

10- Vask med destillert vann.

11- La den tørke og prøven tas til mikroskopet.

Sporene vises røde og bacilliene blå. Det er viktig å ikke puste inn dampene, da de er giftige og på lang sikt kan være kreftfremkallende.

Endret Möeller-teknikk uten varme

I 2007 opprettet Hayama og hans samarbeidspartnere en modifisering av Möeller-teknikken. De eliminerte trinnet med å varme opp fargestoffet og erstattet det ved å tilsette 2 dråper overflateaktivt middel Tergitol 7 for hver 10 ml karbol fuchsin-karbol-løsning. De samme resultatene ble oppnådd.

applikasjoner

Farging av sporer gir veldig verdifull og nyttig informasjon for identifisering av patogenet, siden dets tilstedeværelse, dens form, beliggenhet i bacillus og evnen til å deformere den vegetative cellen eller ikke, er data som kan veilede arten involvert i en viss sjanger.

I denne sammenhengen er det verdt å si at sporer kan være runde eller ovale, de kan være lokalisert i sentrum eller også i en paracentral, subminal eller terminalstilling.

Diagram over form og plassering av endosporer og eksosporer

eksempler

- Clostridium difficile danner en oval spore i en terminal stilling som deformerer bacillus.

- Sporen av Clostridium tertium er oval, deformerer ikke bacillus og er lokalisert på terminalnivå.

- Endosporen til Clostridium tetani er terminal og deformerer bacillusen, noe som gir utseende som en trommestikker.

- Sporene til Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy og C. septicum er runde eller subterminale ovale og deformerer bacillus.

- Endosporen til Clostridium sordelli ligger i den sentrale posisjonen, med en svak deformasjon.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. utg.). Argentina, Redaksjonelt Panamericana SA

referanser

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Forslag om en forenklet teknikk for farging av bakteriesporer uten å anvende varme - vellykket modifisering av Moellers metode. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Wikipedia-bidragsytere. Moeller beis. Wikipedia, The Free Encyclopedia. 3. november 2018, 03:28 UTC. Tilgjengelig på: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratoriehåndbok for mikrobiologiske teknikker. Institutt for grunnleggende vitenskapsakademi for mikrobiologi. Nasjonalt polyteknisk institutt.
4. "Endospore." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 25 feb 2018, 10:20 UTC. 10. januar 2019, 02:42: no.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J og samarbeidspartnere. (2006). Arbeidspersonell i det autonome samfunnet Extremadura. Spesifikk agenda bind IV. Redaksjonell MAD. Sevilla-Spania, s. 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). Spesiallaboratorietekniker, Galician Health Service (SERGAS). Spesifikt fagagenda bind 2. Redaksjonell MAD. Sevilla-Spania, s. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. utg.). Argentina, Redaksjonelt Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 utg. Argentina. Redaksjonell Panamericana SA