GIEMSA FLEKK: BEGRUNNELSE, MATERIALER, TEKNIKK OG BRUKSOMRÅDER - BIOLOGI - 2026

Den Giemsa-farge er en form for farging kliniske prøver, basert på blandingen av sure og basiske fargestoffer. Dets opprettelse var inspirert av arbeidet utført av Romanowsky, der Gustav Giemsa, en kjemiker og bakteriolog opprinnelig fra Tyskland, perfeksjonerte det ved å tilsette glyserol for å stabilisere forbindelsene.

Endringene generert til den opprinnelige Romanowsky-teknikken tillot å forbedre de mikroskopiske observasjonene betraktelig, derfor ble teknikken døpt med navnet Giemsa-flekken.

Ulike prøver farget med Giemsa-flekk. A. Trypanosoma evansi i perifert blod. B. Normale blodceller. C. Borrelia theileri i perifert blod. D. Burkitt lymfom.

Fordi det er en enkel teknikk å utføre, svært funksjonell og økonomisk, er den for tiden mye brukt i det kliniske laboratoriet for hematologisk utstryk, benmargsprøver og vevsseksjoner.

Giemsa-fargingsteknikken er veldig nyttig for cytologiske studier, ettersom den muliggjør observasjon av spesifikke cellestrukturer. Denne teknikken flekker cytoplasmer, kjerner, nukleoli, vakuoler og granulater av celler, og kan skille jevn fine spor av kromatin.

Videre kan det påvises betydelige endringer i kjernenes størrelse, form eller farge, der det er mulig å visualisere tapet av forholdet mellom nukleus-cytoplasma.

På den annen side tillater det å identifisere umodne celler i benmarg og perifert blod, og er viktig for diagnosen alvorlige sykdommer som leukemi. Det er også mulig å oppdage hemoparasitter, ekstra og intracellulære bakterier, sopp, blant andre.

I cytogenetika er det mye brukt, siden det er mulig å studere mitosen til celler.

Grunnlag for Giemsa-farging

Romanowsky-fargestoffer er basert på å bruke en kontrast mellom sure og basiske fargestoffer for å oppnå farging av henholdsvis basiske og sure strukturer. Som det kan sees, er det en affinitet av syrefargestoffer for å flekker grunnleggende strukturer og omvendt.

Det grunnleggende fargestoff som brukes er metylenblått og dets oksiderte derivater (Azure A og Azure B), mens syrefargestoffet er eosin.

Syrestrukturen til cellene er nukleinsyrene, granulatene til de segmenterte basofiler, blant andre, derfor vil de være farget med metylenblått.

I denne samme forstand er basestrukturen til celler hemoglobin og noen granulater som de som er inneholdt i segmenterte eosinofiler, blant andre; disse vil være farget med eosin.

På grunn av det faktum at metylenblått og asurblått er preget av å være metakromatiske fargestoffer, kan de gi en variabel fargetone til de forskjellige strukturer i henhold til belastningen med polyanioner de har.

Slik klarer den strategiske kombinasjonen av basiske og syrefargestoffer å utvikle et bredt spekter av farger, i henhold til de biokjemiske egenskapene til hver struktur, og går gjennom blekblå, mørkeblå, syrin og lilla farger i tilfelle av syrestrukturer.

Mens fargen som leveres av eosin er mer stabil, genererer farger mellom rødoransje og laks.

materialer

Materialer for klargjøring av bestandsløsningen

Fremstilling av stamløsningen krever veie 600 mg pulverisert Giemsa-flekk, måle 500 cm3 acetonfri metylalkohol og 50 cm3 nøytralt glyserin.

Hvordan forberede aksjeløsningen

Legg det tunge Giemsa-pulveret i en morter. Hvis det er klumper, skal de sprayes. Tilsett deretter en betydelig mengde av det målte glyserin og bland veldig godt. Den oppnådde blanding helles i en veldig ren gul flaske.

Resten av glyserinet legges i mørtelen. Bland igjen for å rengjøre resten av fargestoffet som har satt seg fast i mørtelens vegger og hell i samme krukke.

Flasken lukkes og legges i vannbad ved 55 ° C i 2 timer. Mens den ligger i et vannbad, rister du blandingen forsiktig hver halvtime.

Deretter får blandingen avkjøles for å plassere alkoholen. Tidligere blir en del av den målte alkoholen plassert i mørtelen for å vaske den gjenværende fargestoffet og deretter tilsettes den til blandingen sammen med resten av alkoholen.

Dette preparatet skal la det modne i minst 2 uker. Den brukte delen av stamoppløsningen skal filtreres.

For å unngå forurensning av preparatet, anbefales det å overføre den delen som vil være i konstant bruk til en liten ravflaske med en dropper. Påfyll hver gang reagenset går tom.

Materialer for å tilberede bufferen

På den annen side blir en bufferoppløsning ved pH 7,2 fremstilt som følger:

6,77 g natriumfosfat (vannfritt) (NaHPO ₄ ), 2,59 g kaliumdihydrogenfosfat (KH ₂ PO ₄ er) og destillert vann veies opp til 1000 cc.

Endelig klargjøring av fargestoffet

For fremstilling av den endelige fargeløsningen måles 2 ml av den filtrerte stamoppløsningen og blandes med 6 ml av bufferløsningen. Rør blandingen.

Et relevant faktum som må tas i betraktning er at teknikkene for tilberedning av fargelegging kan endres avhengig av det kommersielle selskapet.

Ytterligere materialer som trengs for å utføre fargelegging

Bortsett fra de beskrevne materialene, må du ha fargeleggbroer, t-skjorter med vann eller buffer for vasking, objektglass eller deksler til gjenstander, et stoppeklokke for å kontrollere fargeleggingstider og blottingpapir eller noe materiale som kan brukes til å tørke ( gasbind eller bomull).

Teknikk

Farging prosess

1) Før farging må prøvesprutningen være klar på et rent lysbilde.

Prøvene kan være blod, benmarg, histologiske vevsseksjoner eller cervico-vaginale prøver. Det anbefales at oppslagene skal være tynne og ha 1 eller 2 timers tørking før fargelegging.

2) Plasser alle arkene som må farges på en fargelegg. Du jobber alltid i samme rekkefølge, og hvert ark er godt identifisert.

3) Plasser noen få dråper 100% metylalkohol (metanol) på smøringen og la den virke i 3 til 5 minutter for å fikse og dehydrere prøven.

4) Kast metanolet som er tilstede på arket, og la lufttørke.

5) Når den er tørr, plasser den endelige fargeløsningen med en dropper til hele arket er dekket. La stå og virke i 15 minutter. Noen forfattere anbefaler opptil 25 minutter. Det kommer an på forretningshuset.

6) Tøm flekken og vask smøringen med destillert vann eller med en 7,2 bufferløsning.

7) La arkene tørke i friluft på et blottingpapir, anordnet vertikalt ved hjelp av en støtte.

8) Rengjør baksiden av lysbildet med en alkoholpinne eller bomullspinne for å fjerne spor av flekker.

verktøy

Giemsa-fargingsteknikken brukes på forskjellige områder, blant dem: hematologi, mykologi, bakteriologi, parasitologi, cytologi og cytogenetikk.

hematologi

Det er den hyppigste bruken som gis til denne flekken. Med den kan hver og en av cellene som er til stede i benmargs- eller perifere blodprøver identifiseres. I tillegg til å estimere antall for hver serie, kunne oppdage leukocytose eller leukopeni, trombocytopeni, etc.

Fordi det er følsomt når det gjelder å identifisere umodne celler, er det relevant i diagnosen akutte eller kroniske leukemier. Det er også mulig å stille diagnosen anemi, for eksempel sigdcelleanemi, sigdcelle, blant andre.

mykologi

I dette området er det vanlig å søke etter Histoplasma capsulatum (intracellulær dimorf sopp) i vevsprøver.

bakteriologi

Ved hematologisk utstryking farget med Giemsa er det mulig å oppdage Borrelias sp hos pasienter som har sykdommen kalt tilbakevendende feber. Spirochetes er rikelig blant erytrocytter, i prøver tatt på toppen av feberen.

Det er også mulig å visualisere intracellulære bakterier som Rickettsia sp og Chlamydia trachomatis i infiserte celler.

parasittologi

På området parasitologi har farging av Giemsa gjort det mulig å diagnostisere parasittiske sykdommer som malaria, Chagas sykdom og leishmaniasis.

I de to første kan henholdsvis Plasmodium sp og Trypanosoma cruzi parasitter sees i perifert blod fra infiserte pasienter, de kan finnes i forskjellige stadier avhengig av sykdomsstadiet.

For å forbedre søket etter parasitter i blod, anbefales det å bruke Giemsa-flekken blandet med May-Grünwald-flekken.

På samme måte kan kutan leishmaniasis diagnostiseres ved å evaluere Giemsa-fargede hudbiopsiprøver der parasitten er funnet.

cytologi

Giemsa-farging brukes også til den cytologiske undersøkelsen av endocervikale prøver, selv om det ikke er den mest brukte teknikken for dette formålet.

Men i tilfeller av knapphet på ressurser kan den brukes, med en lignende funksjonalitet som den som tilbys av Papanicolaou-teknikken og til en lavere pris. Det krever imidlertid kompetanse fra sensor.

cytogenetikk

Et relevant trekk ved Giemsa-farging er dens evne til å binde seg sterkt til adenin- og timymrike regioner av DNA. Dette gjør det mulig å visualisere DNA under cellemitose, i forskjellige kondensstilstander.

Disse studiene er nødvendige for å påvise kromatiske avvik, som duplikasjoner, delesjoner eller translokasjoner av de forskjellige områdene i kromosomene.

Forskning som viser effekten av Giemsa-flekken

Cannova et al (2016), sammenlignet 3 fargeteknikker for diagnostisering av kutan leishmaniasis.

For dette brukte de prøver hentet fra et forsøksdyr (Mesocrisetus auratus) eksperimentelt inokulert med Leishmanias.

Forfatterne demonstrerte at Giemsa-flekken var bedre enn Pap-mart® og Gaffney-flekken. Derfor vurderte de Giemsa-flekken som ideell for å diagnostisere kutan leishmaniasis.

De utmerkede resultatene oppnådd av forfatterne skyldes det faktum at kombinasjonen av fargestoffer som utgjør Giemsa-blandingen presenterer de nødvendige betingelser for å skape en gunstig kontrast, slik at strukturene til amastigoter kan skilles tydelig, både intra og ekstracellulært.

De andre teknikkene (Pap-mart® og Gaffney) gjorde det også, men på en svakere måte og derfor vanskeligere å visualisere. Derfor anbefales Giemsa-flekken for den parasitologiske diagnosen leishmaniasis.

På samme måte evaluerte en studie av Ramírez et al (1994) gyldigheten av Giemsa og Lendrum flekker i konjunktival utstryk for identifisering av Chlamydia trachomatis.

Forfatterne slo fast at Giemsa og Ledrum-flekker har samme spesifisitet, men Giemsa ble funnet å være mer følsom.

Dette forklarer hvorfor Giemsa-flekken for tiden er den mest brukte for diagnostisering av klamydiale infeksjoner, spesielt hvis det er få ressurser.

Kilde: PanReac Applichem ITW-reagenser. Giemsa flekk. Versjon 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spania.

Anbefalinger for god farging

Tørkingen av arkene skal ikke akselereres. Det må forventes en rimelig tid å tørke den i friluft. Cirka 2 timer.

Fargelegg umiddelbart etter 2 timer for best resultat.

For at utstrykene skal fikses og flekker bedre, må prøven fordeles på lysbildet på en slik måte at et tynt og jevnt lag blir igjen.

Den foretrukne blodprøven er kapillær, siden utstrykningen er laget direkte fra bloddråpen, og prøven derfor ikke inneholder noen tilsetningsstoffer, som favoriserer vedlikehold av cellestrukturer.

Hvis venøst ​​blod brukes, bør imidlertid EDTA brukes som et antikoagulasjonsmiddel og ikke heparin, siden heparin vanligvis deformerer celler.

Vanlige feil ved Giemsa-farging

I utøvelsen av denne fargeleggingen kan det gjøres feil. De er dokumentert av plutselige endringer i tonalitetene i strukturen.

Ekstremt blå fargelegging

Det kan skyldes:

• Veldig tykk utstryk
• Overskridende fargetid
• Vask utilstrekkelig.
• Bruk av reagenser godt over nøytral (alkalisk) pH.

Under disse forholdene er fargene på følgende strukturer forvrengt, på en slik måte at erytrocyttene i stedet for å farge lakserosa vil virke grønne, granulatene til eosinofilene som må være farget mursteinsrøde vil bli blå eller grå og så videre vil det være avvik i de vanlige tonene.

Overdreven rosa fargelegging

Det kan skyldes:

• Utilstrekkelig fargetid.
• Langvarig eller overdreven vask.
• Dårlig tørking.
• Bruk av svært sure reagenser.

I dette spesielle tilfellet vil strukturer som normalt beiser blått ikke være nesten synlige, mens strukturer som farger rosa vil ha sterkt overdrevne fargetoner.

Eksempel: Røde blodlegemer vil bli knallrøde eller knalloransje, kjernekromatin vil vises blekrosa, og eosinofilgranulater vil farge dypt knallrødt.

Tilstedeværelse av presipiterer i smøret

Årsakene kan være:

• Bruk skitne eller dårlig vasket film.
• Ikke la smøret tørke godt.
• Forlater fikseringsløsningen for lenge.
• Mangelfull vasking etter endt farging.
• Utilstrekkelig filtrering eller ingen filtrering av det anvendte fargestoffet.

Tilstedeværelse av morfologiske gjenstander

Morfologiske gjenstander kan vises i utstryk, noe som gjør det vanskelig å visualisere og tolke strukturene som er til stede. Dette er på grunn av:

• Type antikoagulantia som brukes, for eksempel heparin.
• Bruk av skitne, forringede eller fete filmer.

Lagringsmodus

Etter tilberedning må fargestoffet holdes ved romtemperatur (15 - 25 ° C) for å forhindre at fargestoffet faller ut. Den skal oppbevares i en tett lukket ravbeholder.

referanser

1. Cannova D, Brito E og Simons M. Evaluering av fargeteknikker for diagnose av kutan Leishmaniasis. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applichem ITW-reagenser. Giemsa flekk. Versjon 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spania.
3. Clark G. Staining procedures (1981), fjerde. Williams & Willkins.
4. Anvendt klinisk kjemi. Giemsa-flekk for in vitro-diagnostikk. Distributør: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F og Grazioso C. Validitet av Giemsa og Lendrum flekker i konjunktival utstryk for identifisering av Chlamydia trachomatis. Bol of Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Generell mykologi. 1994. 2. utg. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
7. "Giemsa beis." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 1. september 2017, 01:02 UTC. 6. desember 2018, es.wikipedia.org.