GRAMBEIS: BEGRUNNELSE, MATERIALER, TEKNIKK OG BRUKSOMRÅDER - BIOLOGI - 2026

Den gramfarging er den enkleste og mest anvendbare farging teknikk i diagnostisk mikrobiologi. Denne teknikken ble laget av den danske legen Hans Christian Gram i 1884, som klarte å klassifisere bakterier som Gram-positive og Gram-negative, i samsvar med celleveggenes sammensetning.

Teknikken gjennomgikk visse modifikasjoner av Hucker i 1921 for å stabilisere reagensene og forbedre kvaliteten på farging, og det er grunnen til at Gram-flekken også er kjent som Gram-Hucker.

Ulike flekker flekker med Gram-flekker. A. Gram positive kokker. B. Gram negative stenger. C. Gram-positive, polymorfonukleære og mononukleære baciller. D. Gjær.

Med denne teknikken er det også mulig å observere formen til mikroorganismene, det vil si hvis de er kokker, baciller, kokkobaciller, pleomorfe, filamentøse, blant andre. Så vel som fordelingen i rommet: i en klynge, i en kjede, isolert, i par, i tetrader osv.

Når det er mistanke om en bakteriell infeksjon, bør de fleste av prøvene som mottas smøres på et lysbilde og Gram farges for mikroskopisk undersøkelse.

Gram-rapporten vil veilede legen om hvilken type mikroorganisme som kan være årsaken til infeksjonen, før det endelige kulturresultatet oppnås.

I noen tilfeller er pasientens liv veldig kompromittert, derfor trenger leger øyeblikkelig Gram-rapporten for å utføre en empirisk behandling, mens de venter på å identifisere mikroorganismen.

Hvis for eksempel Gram avslører at det er Gram-positive kokker i cerebrospinalvæsken, vil legen veilede den første behandlingen med antibiotika som eliminerer denne typen bakterier, i henhold til protokollene som er etablert for dette.

Når det endelige resultatet kommer med navnet på den isolerte mikroorganismen og dets respektive antiogram, vil legen vurdere om den skal endre terapi eller ikke. Denne avgjørelsen vil bli tatt i samsvar med studien om mikroorganismens mottakelighet for antibiotika han mottar og pasientens utvikling.

Basis

Dette er en teknikk som har 4 grunnleggende trinn: farging, fiksering med mordanten, misfarging og motdekking. Derfor lar denne teknikken, i tillegg til å fargelegge bakteriene, også differensieres.

Krystallfiolett er den første fargestoffet som brukes. Den har en affinitet for peptidoglycan og vil flekker alle bakteriene som er til stede lilla, deretter blir lugolen plassert, som fungerer som en mordant, det vil si at den vil indusere dannelse av uoppløselige krystallfiolett-jodkomplekser - ribonukleære proteiner i cellen. .

Gram-positive bakterier, som har en tykk vegg av peptidoglykan, danner mer komplekser (krystallfiolett-jod), derfor beholder de fargestoffet.

I tillegg påvirker det også at veggen av Gram-positive bakterier inneholder en større mengde umettede syrer, som viser stor affinitet for oksidasjonsmidler (Lugol).

I mellomtiden har gramnegative bakterier et tynt lag med peptidoglykan, noe som får bakteriene til å danne mindre komplekser enn Gram-positive.

Så kommer misfargingstrinnet, der Gram-positive og Gram-negative bakterier oppfører seg annerledes.

Gram-negative bakterier inneholder en ytre membran rik på lipopolysakkarider som er en del av celleveggen deres. Fett blir ødelagt ved kontakt med acetonalkohol, slik at den ytre membranen blir destabilisert og frigjør den fiolette krystallen.

Slik motvirkes det med safranin eller basisk fuchsin, og blir rød.

Når det gjelder Gram-positive bakterier, motstår de å falme fordi blekemiddelet fungerer ved å lukke porene, og forhindrer at krystallfiolett / jodkomplekset lekker ut.

Derfor forblir fargen med krystallfiolett stabil, og det er ikke rom for safranin eller fuchsin. Dette er grunnen til at disse bakteriene beis dypt blå eller lilla.

materialer

Grams fargesett består av:

• Fiolett glass
• lugol
• Acetonalkohol
• Safranin eller grunnleggende fuchsin

Fremstilling av fargestoffer og reagenser

Krystallfiolett løsning

Løsning på:

Fiolett krystall ------------- 2 gr

Etylalkohol 95% ----------- 20cc

Løsning B:

Ammoniumoksalat ----------- 0,8 gr

Destillert vann ------------- 80 cc

For den endelige tilberedningen av krystallfiolett, må løsning A fortynnes 1:10 med destillert vann og blandes med 4 deler løsning B. Blandingen oppbevares i 24 timer før bruk. Filtrer i en ravfarget flaske ved hjelp av filterpapir.

Mengden som skal brukes daglig blir overført til en ravdråpeflaske.

Jod-Lugols

Vei og mål den angitte mengden av hver forbindelse, som følger:

Jodkrystaller ------------- 1gr

Kaliumjodid ------------- 2gr

Destillert vann ------------- 300 cc

Kaliumjodid løses opp litt etter litt i vannet og tilsettes jod. Løsningen barberes i en ravflaske.

Mengden som skal brukes daglig overføres til en mindre ravflaske med en dropper.

bleking

95% etylalkohol -----------– 50 ml

Aceton ------------------ 50 ml

Det tilberedes i like deler. Dekk godt til, da det har en tendens til å fordampe.

Plasser i en dropperflaske.

Dette preparatet gir en misfarging i moderat tid 5-10 sekunder og er det mest anbefalte.

Nybegynnere foretrekker å bruke bare 95% etylalkohol, der falming er tregere enn 10 til 30 sek.

Mens de mer erfarne kan bruke ren aceton, hvor misfarging skjer veldig raskt fra 1 til 5 sek.

Kontrast

Safranin lagerløsning

Safranina -------------– 2,5 gr

Etylalkohol 95% --------– 100 cm3

Etter å ha veid den angitte mengden safranin, blir den oppløst i 100 ml 95% etylalkohol.

Den fungerende safraninløsningen blir fremstilt fra stamløsningen.

For å gjøre dette måler du 10 cc av stamløsningen, tilsett 90 cm destillert vann for å lage 100 ml.

Det anbefales å overføre mengden som skal brukes daglig til en ravflaske med en dropper.

Mikroorganismer som farger svakt Gram-negativt med Gram-Hucker-flekken, slik som visse anaerober, Legionella sp, Campylobacter sp og Brucella sp, kan farges mye bedre ved å bruke Kopeloffs modifisering av Gram-Hucker-flekken, kalt Gram-Kopeloff-flekken.

Denne teknikken endrer safraninfargestoffet til grunnleggende fuchsin. Med denne modifikasjonen er det mulig å fargelegge de nevnte mikroorganismer effektivt.

Reagenslagring

Tilberedte fargestoffer skal oppbevares ved romtemperatur.

Forberedelse av utstryking av prøven som skal farges

En prøve må inneholde minst 10 ⁵ mikroorganismer før observasjon av mikroorganismen i et utstryk er sannsynlig. Smørene kan lages fra den direkte prøven eller fra kulturer i faste eller flytende medier.

Utstrykene skal være jevn, godt fordelt og ikke for tykke, for en bedre visualisering av strukturene som er til stede.

-Grammet av direkte prøver

Gram av usentrifugert urin

Urinen blandes og 10 ul plasseres på et lysbilde. Observasjonen av minst ett bakterie / Dip-felt indikerer at det er en infeksjon.

Dette betyr at kulturen vil ha omtrent mer enn 100 000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) urin i 85% av tilfellene.

Denne metoden er ikke nyttig for kolonitelling under 100 000 CFU.

CSF Gram

CSF skal sentrifugeres, supernatanten fjernes og pelleten spres på et lysbilde. Denne væsken er steril under normale forhold; observasjon av bakterier indikerer infeksjon.

Gram av luftveisprøver

Sputum, bronkial eller bronkoalveolar skylling Gram, selv om det kan være en rekke mikroorganismer, vil alltid være ledende for diagnosen, i tillegg til at det er nyttig den typen celler som er observert.

Når det gjelder sputum, bør smøringen tilberedes med de mest purulente delene av prøven.

Gram av avføring

Det anbefales ikke å utføre en Gram på denne typen prøver, siden den ikke har noen diagnostisk verdi.

-Gram avlinger

De kan gjøres på to måter, den ene fra flytende kulturer og den andre fra faste kulturer.

Flytende kulturer

Fra flytende kulturer er det ekstremt enkelt; Flere steker av den uklare buljongen blir tatt under brenneren og plassert på et rent og tørt lysbilde, noe som gjør sirkulære bevegelser fra sentrum mot periferien, for å fordele materialet jevnt.

La det tørke spontant i luften. Når det er tørt, blir materialet festet til arket med varme. For å gjøre dette, ved hjelp av en pinsett, føres arket 3 til 4 ganger gjennom flammen til Bunsen-brenneren, og pass på at du ikke brenner materialet.

Arket får avkjøles og legges på fargelegget.

Solide avlinger

For å utføre en smøre for Gram-flekker fra en solid kultur, gjør du som følger:

Før du velger koloniene som skal tas, bør lysbildet forberedes, og plasser omtrent to dråper steril fysiologisk saltløsning.

Hvis den opprinnelige kulturplaten inneholder flere forskjellige typer kolonier, vil en isolert koloni av hver velges for å utføre Gram. Hver koloni vil bli tatt med platina-løkken for å løse opp i saltløsningen som tidligere var plassert på lysbildet.

Sirkulære bevegelser gjøres fra sentrum mot periferien, for å homogent distribuere kolonien på lysbildet.

La det tørke spontant i luften. Når det er tørt, blir arket festet med varme, som tidligere forklart (ved å flamme lysbildet med lighteren), og pass på ikke å brenne materialet.

Denne prosedyren må gjøres med hver forskjellige kolonitype. På et stykke papir bør rekkefølgen på hva som er observert, legges merke til, for eksempel:

Koloni 1: Betahemolytisk gul koloni: Gram-positive kokker ble observert i klynger

Koloni 2: Kremfarget koloni, uten hemolyse: Gram-negative coccobacilli ble observert.

Hvert lysbilde må merkes for å vite hva vi ser på.

Teknikk

Gram-fargingsteknikken er ekstremt enkel å utføre og relativt billig og kan ikke gå glipp av i et mikrobiologisk laboratorium.

Det gjøres som følger:

1. Fest smøret med varme og legg på fargebroen.
2. Dekk lysbildet helt med krystallfiolett i 1 minutt.
3. Vask av med vann Ikke tørk
4. Dekk arket med lugoloppløsning, la det virke i 1 minutt. Vask av med vann Ikke tørk.
5. Blek i 5-10 sekunder med forsiktig risting i alkoholaceton. Eller legg arket i en vertikal stilling og slipp dråper av fargestoffet på overflaten til overskuddet av ikke-beholdt fiolett glass er fjernet. Ikke overskrid.
6. Vask av med vann Ikke tørk.
7. Bytt lysbilde på fargebroen og dekk i 30 sekunder med safranin (Gram-Hucker) eller 1 min med grunnleggende fuchsin (Gram-Kopeloff).
8. Vask med vann
9. La den lufttørke spontant i stående stilling.

Når den er tørr, plasser en dråpe nedsenkingolje for å observere den under 100X objektivet i lysmikroskopet.

Nytte

Denne teknikken gjør det mulig å skille de morphotintorielle forskjellene til de fleste bakterier.

Gjær utmerker seg også ved denne fargen. De tar krystallfiolett, det vil si at de beiser Gram-positive.

På den annen side kan sporedannende Gram-positive baciller skilles, der det er observert et klart rom i bacillus, der endosporen dannet seg, selv om sporer ikke farger godt. Andre teknikker som Shaeffer-Fulton brukes til å flekker sporer.

Det skal bemerkes at denne fargingen ikke brukes til å fargelegge alle typer bakterier, det vil si at det er tilfeller der fargingen ikke fungerer.

I dette tilfellet kan bakterier som mangler en cellevegg nevnes. For eksempel: slekt Mycoplasma, sferoplaster, ureaplasma, L-former og protoplaster.

Det flekker også veldig dårlig bakterier med vegger som er rike på mykolsyrer, for eksempel Mycobacteria, og intracellulære bakterier som Chlamydias og Rickettsias.

Det er også ineffektivt med å farge de fleste spirochetalbakterier.

Det er bakterier av samme slekt som kan observeres i samme prøve som Gram-positiv og Gram-negativ. Når dette skjer kalles det variabel gramfarging, som kan skyldes endring i næringsstoffer, temperatur, pH eller elektrolyttkonsentrasjon.

Vanlige feil

Overdrevet bleking

Overdrivelse i misfargingstrinnet kan føre til observasjon av falske gram-negative mikroorganismer.

Venter ikke lenge nok tørketid for å tilsette fordypningsoljen

Det kan føre til at Gram-positive bakterier pletter Gram-negativ (falsk Gram-negativ). Dette skjer fordi det i gamle kulturer sannsynligvis er døde eller bortskjemte bakterier, og under disse forholdene beholder ikke bakteriene krystallfiolett.

Bruk veldig gammel lugol-løsning:

Over tid mister lugolen sine egenskaper og fargen blekner. Hvis det allerede degenererte reagenset blir brukt, vil det ikke fikse krystallfiolett godt, derfor er det en mulighet for å få en visualisering av falsk Gram-negative mikroorganismer.

Blå bakgrunn

En riktig misfarget bakgrunn vil være rød. En blå bakgrunn indikerer at misfargingen var utilstrekkelig.

referanser

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medical Microbiology, 6. utgave McGraw-Hill, New York, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. utg.). Argentina, Redaksjonelt Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 utg. Argentina. Redaksjonell Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Generell mykologi. 2. utg. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
5. "Gram stain." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 4 okt 2018, 23:40 UTC. 9. des 2018, 17:11. Hentet fra es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manual of Medical Microbiology. 2. utgave, Venezuela: Direktoratet for medier og publikasjoner ved University of Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Grunnflekker i mikrobiologilaboratoriet. Forskning innen funksjonshemming. 2014; 3 (1): 10-18.