WRIGHTS FLEKK: BEGRUNNELSE, MATERIALER, TEKNIKK OG BRUKSOMRÅDER - BIOLOGI - 2026

The Wright flekken er et farging teknikk skapt av den amerikanske patologen James Homer Wright i 1902, basert på Romanowsky flekken. Siden Romanowsky-flekken var ustabil, innlemmet Wright metanol som løsemiddel og fikseringsmiddel.

Denne fargeleggingen er polykromatisk, noe som betyr at den genererer flere farger avhengig av strukturen som absorberer fargestoffet. Denne fargingsteknikken har blitt mye brukt til å utføre differensialt antall hvite blodlegemer og for å studere morfologien til røde blodlegemer, blodplater og leukocytter i perifert blod og benmarg.

Ulike perifere blodutstryk flekker med Wrights flekk. A. Akutt leukemi B. Plasmodium vivax i erytrocyten. C. Plasmodium falciparum, makrogametocytt. D. Lymfocytt

Bruken av den er veldig viktig, siden det kan sees unormalt i de forskjellige cellelinjene i blodet, noe som letter diagnosen sykdommer som leukemi eller bakterielle eller parasittiske infeksjoner.

Kanskje er dette de vanligste bruksområdene som denne teknikken brukes, men de er ikke de eneste. Det er også nyttig i andre prøver enn blod og benmarg, for eksempel neseutslipp, fekalt slim, sputum, hudprøver, blant andre.

Begrunnelse for Wrights flekk

Wrights flekk ble født fra Romanowskys flekk, som består av en metylalkoholoppløsning av et surt fargestoff (eosin Y) og et basisk fargestoff (metylenblått) og oksidasjonsproduktene deres.

Blandingen av fargestoffer som brukes i Wrights flekk forårsaker effekten kjent som Romanowsky, det vil si at den gir en vakker lilla farge til kjernene i leukocytter og nøytrofile granuler, mens de røde blodcellene farger rosa.

Komponentene som er ansvarlige for å gi den typiske fargespekteret til Wrights flekk er blå B og eosin Y. Effekten som observeres vil avhenge av bindingen av fargestoffene til de kjemiske strukturer og interaksjonen mellom blå B og eosin Y.

Sure strukturer som nukleinsyrer, nukleære proteiner og den reaktive umodne cytoplasma av noen celletyper, fikser blå B (grunnfarging).

Mens basale strukturer som hemoglobin, binder granulatene av segmenterte eosinofiler, blant andre cellulære strukturer, eosin Y (surt fargestoff).

Fargningsresultatet kan påvirkes av forskjellige faktorer, for eksempel pH i Wright-fargestoffet, bufferen og vaskeoppløsningen; samt farging og fikseringstid.

Derfor er hvert trinn i fremstillingen av reagensene avgjørende og må utføres med hensyn til hver detalj.

materialer

Wrights flekk. For 100 ml kreves det:

Vei 0,3 g Wrights flekk, mål 97 ml metanol og 3 ml glyserol.

Forberedelse

I en morter, legg den tunge mengden av Wrights fargestoff og integrer gradvis glyserolen til pulveret er helt oppløst.

Deretter tilsettes metanolen, blandes og helles i en ravflaske.

Før bruk skal løsningen ristes med forsiktige bevegelser og filtreres.

Bufret bufferløsning

I en liter destillert vann, 3,76 g dinatrium hydrophosphate (Na ₂ HPO ₄ 2 H ₂ 0) pluss 2,1 g dihydrogen kaliumfosfat (KH ₂ PO ₄ tilsettes).

Bland veldig godt til alle inkorporerte reagenser er oppløst. Juster pH til 7,2. Hell i en glasskrukke og hold ved romtemperatur.

Ytterligere materialer som trengs for å utføre fargelegging

I tillegg er det nødvendig med andre materialer for å kunne utføre fargeteknikken, dette er: objektglid eller dekker gjenstander, fargelegg, t-skjorter med vann eller buffer for vasking, en tidtaker for å holde fargeleggingstidene og noe tørkemateriale (absorberende papir, gasbind eller bomull).

Komponenter av Wrights flekk

metanol

Alkohol (metanol) fungerer som et fikseringsmiddel for blodsmetningen til lysbildet.

Det er i utgangspunktet et koaguleringsmiddel som reduserer, dehydrerer og fikserer reagens. Derfor er dens funksjon å koagulere proteiner og gjøre dem uoppløselige, men uten å denaturere dem.

Metanol er det mest brukte smørefiksjonsreagenset i alle laboratorier, da det gir bedre resultater enn etanol. Den ideelle konsentrasjonen er 99%.

spjeld

Bufferen (bufret oppløsning) har funksjonen til å justere eller opprettholde pH i fargestoffet, siden en pH justert til 7,2 er viktig for at cellestrukturene skal kunne absorbere fargestoffene riktig.

På den annen side dehydrerer metanolfikseringstrinnet cellene og bufferen er med på å rehydrere dem.

Eosin (Y)

Eosin har en tilhørighet til byggesteiner fordi det er et surt fargestoff. To typer eosin er kjent veldig lik hverandre, så mye at en av de to kan brukes, og oppnår samme resultat.

Den ene kalles eosin Y, gult eosin eller tetrabromofluorescein, og den andre kalles eosin B, blålig erythrosin B eller dibromodinitrofluorescein. Imidlertid er eosin Y det mest brukte.

Den viktigste egenskapen til dette fargestoffet er dets negative polaritet, dette gjør at det tiltrekkes av positivt ladede cellestrukturer.

Metylenblått

Det er grunnfargingen. Den viktigste egenskapen er metakromasia, det vil si at ikke alle strukturer vil være farget i samme farge, det avhenger av den kjemiske sammensetningen av strukturer som farges.

Noen vil bli lyse eller mørkeblå, og andre vil bli mørk lilla eller blek syrin.

Teknikk

1-Utfør spredningen av prøven slik at det blir igjen en tynn film, enten på et lysbilde eller dekkglass.

2-La det tørke i luften i cirka 2 timer.

3-Plasser tørrsmøringen på fargebroen eller fargebrettet med prøvespredningen opp.

4-dekk arket med Wright-flekken dråpe for dråpe til hele overflaten er dekket. La stå i 5 - 8 minutter.

5-Flekken skal dekke lysbildet helt uten å søle over kantene. Hvis det begynner å fordampe i løpet av fargeleggingstiden, tilsett noen ekstra dråper.

6 - Tilsett deretter en like stor mengde støtdemper, blåse litt til den karakteristiske metalliske glansen vises. Tid 10 til 15 minutter.

7-vask med vann fra springen, legg den milde strømmen til arket ser rosa ut.

8-Fjern fargestoffet som er festet på baksiden av lysbildet med et gasbind dynket i alkohol.

9-La smøren tørke veldig godt før du plasserer fordypningsoljen for å se den under mikroskopet.

Nytte

hematologi

Det er ideelt for farging av perifert blodutstryk, for undersøkelse av tykk blodutstryk og for studier av celler fra benmargsprøver.

På grunn av de kjemiske egenskapene til denne kombinasjonen av fargestoffer, kan cellestrukturer lett gjenkjennes, og de forskjellige celletyper som er til stede, kan skilles ut.

Rennende nese

Denne teknikken er veldig nyttig for å identifisere celler fra neseutslippet (epitelceller, segmenterte eosinofiler, polymorfonukleære celler) ved diagnosen allergisk rhinitt.

parasittologi

I denne forstand har det vært nyttig for studien av Leishmania sp innenfor histiocyttene til det subkutane cellevevet i hudsår. På samme måte brukes den til å identifisere leukocytter i avføringsprøver (fekal leukogram).

I dette tilfellet er det av interesse for legen å vite om leukocytosen til stede i avføringen er polymorfonukleær eller mononukleær. Dette funnet i fekal leukogram vil lede om det er henholdsvis en bakteriell eller virusinfeksjon.

På den annen side kan parasitter som sirkulerer i blodet finnes i erytrocyten eller fri i plasma. Parasittene som søkes er Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii og filariae, og innen veterinærmedisin er det nyttig i jakten på Theileria equi og Babesia caballi, årsaksmidler til bebesiosis, spesielt hos hester.

Wright-flekken og også Giemsa-flekken gjør det mulig å skille hemoparasitter fra normale cellulære komponenter. To typer oppslag kan brukes til dette:

Fordel tynt

Blod spres som en tynn film på et lysbilde. Den er beiset med Wrights flekk, og avslører kjennetegnene til kjernen og cytoplasma.

Tykk dråpe

Denne metodikken brukes til å undersøke tilstedeværelsen av parasitter i en større mengde blod.

For å gjøre dette plasseres en stor dråpe blod på et lysbilde. Når den først er der, må den defibrilleres, lage større og større sirkler fra midten og utover, ved hjelp av kanten til et annet lysbilde.

Til slutt, for å kunne observere parasittene i den tykke utstryningen, må erytrocyttene lyseres med vann.

Luftveisinfeksjoner

På luftveisnivå er denne teknikken også nyttig, fordi cellene som er til stede i prøvene av sputum, bronkialskylling eller bronkoalveolar, er viktige for å etablere diagnosen.

På samme måte kan polymorfonukleære celler og mononukleære celler skilles her.

bakteriologi

Bruken av denne teknikken i bakteriologi er begrenset fordi den ikke er bra for farging av bakterier, og det er grunnen til at andre spesialiserte fargeteknikker brukes til farging av dem.

Imidlertid har den blitt brukt til å søke etter epitelceller med Chlamydia trachomatis inkluderingslegemer i urinrøret eller endocervikalslimhinne, men det må erkjenes at det ikke er den beste metoden for dette.

Det er også mulig å observere spirallignende bakterier som Borrelia burgdorferi blant røde blodlegemer hos infiserte pasienter, så vel som morulae eller inkluderingslegemer av Ehrlichia sp i cytoplasma av lymfocytter, monocytter eller nøytrofiler i en blodutstryking.

mykologi

Histoplasma capsulatum er en sykdomsframkallende sopp ofte diagnostisert ved mikroskopisk observasjon av forskjellige vevsprøver, farget med Wrights flekk.

Hvordan observeres strukturene i blodprøven med Wrights flekk?

Kilde: Retamales E, Mazo V. Institutt for folkehelse, Chile regjering. Anbefalinger for flekker av blodutstryk for å lese hemogrammet.

Anbefalinger for god farging

Blodprøveglassene skal lufttørke spontant. Utskjæringer bør være så tynne som mulig for å oppnå bedre fiksering av fargestoffet og unngå overfarging.

For farging av høy kvalitet, er det lurt å farge innen to timer etter smørepreparat. På den annen side er den ideelle prøven kapillært blod, uten antikoagulant.

Imidlertid, hvis venøst ​​blod brukes, bør det brukes som en antikoagulerende EDTA og ikke heparin, siden sistnevnte kan deformere cellestrukturer.

For å unngå forringelse av det tilberedte fargestoffet, bør det oppbevares på tørre steder.

Under vaskeprosessen anbefales bruk av vann justert til en nøytral pH.

Til slutt anbefales det å teste fargelegningsmetoder som brukes i laboratoriet fra tid til annen.

Dette gjøres ved å farge prøver eller utvide mønstre, som en kvalitetskontroll. Dette trinnet er viktig, ettersom det sikrer at fargingen er riktig forberedt og fargetidene er godt standardiserte.

Hvis mønsterarket er dårlig farget, er det problemer som må løses.

Vanlige feil ved Wright-farging

Veldig blek flekker

Svært bleke utstryk skyldes vanligvis veldig kort flekketid eller overdreven vask. Det korrigeres ved å forlenge kontakttiden med fargestoffet eller redusere vasketiden.

Fargestoff faller ut

Tilstedeværelsen av presipitater av fargestoff i utstrykningen kan ha flere årsaker, men de hyppigste årsakene er: bruk av ufiltrert fargestoff, flekker på ujevn farging av broer, bruk av ark skittent med støv eller fett, ikke vasking godt fullstendig farging.

Ekstremt rød eller blå flekk

Bufferen er ansvarlig for pH i fargestoffet. Fargestoffer med en pH-verdi under det som er indikert (surt) vil føre til veldig rødlig utstryk.

Hvis pH-verdien til fargestoffet er over (alkalisk), vil man oppnå ekstremt blåaktig utstryking.

Lagringsmodus

Reagenset skal lagres ved romtemperatur.

referanser

1. Gutiérrez V. Sammenlignende studie mellom Wright-fargningsmetoden og Elisa-testen for diagnose av hjørnetann Ehrlichiosis i byen San Pedro Sula, Honduras. 2008. Gradsoppgave for å kvalifisere seg til veterinærmedisinsk grad. Universitetet i San Carlos i Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Grunnflekker i mikrobiologilaboratoriet. Forskning innen funksjonshemming. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Wrights flekk." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 18. mai 2018, 12:05 UTC. 8. des 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frees of Babesia spp. i jakthester, Córdoba (Colombia). Pastor udcaactual divulg cient. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 utg. Argentina. Redaksjonell Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Institute of Public Health Government of Chile. Anbefalinger for flekker av blodutstryk for å lese hemogrammet.