REKOMBINANT DNA: TEKNIKK, APPLIKASJONER OG GRUNNLEGGENDE - BIOLOGI - 2026

Det rekombinante DNA (rDNA eller rDNA) er et kunstig nukleinsyremolekyl skapt i laboratoriet ved å integrere to segmenter av interesseorganisasjoner. Det er også kjent som kimært DNA, takket være hybridegenskapene. Denne typen DNA finnes ikke i naturen.

Den grunnleggende metodikken for å generere den inkluderer: (a) valg av et mål-DNA, og det er satt inn i et annet DNA-fragment (generelt et bakterieplasmid); (b) innføring av dette plasmidet i en bakterie, (c) seleksjonen av bakteriene ved hjelp av antibiotika og til slutt (d) uttrykket av genet.

Kilde: pixabay.com

Teknikken drar fordel av et sett med enzymer som gjør det mulig å kopiere og lime inn spesifikke DNA-fragmenter i henhold til forskerens vurdering.

Målet med rekombinant teknologi er i de fleste tilfeller uttrykk for et protein (kjent som rekombinant protein) ønsket av molekylærbiologen for fremtidig forskning eller å skape et protein med kommersiell og terapeutisk verdi - for eksempel humant insulin, for eksempel.

Grunnleggende om rekombinant DNA-teknikk og dens bruk i genteknologi

Det sentrale dogmet i molekylærbiologi

Alle organiske vesener som vi kjenner, deler flere kjennetegn. En av dem er arvestoffet av arvestoffet og hvordan proteiner lages - en prosess kjent som det sentrale "dogmen" i molekylærbiologi.

Med unntak av et par virus lagrer alle organismer genetisk informasjon i DNA (deoksyribonukleinsyre), samlet på en veldig kompakt og organisert måte i cellekjernen.

For genekspresjon blir DNA-molekylet transkribert til messenger-RNA, og sistnevnte blir oversatt til språket til aminosyrer, byggesteinene til proteiner.

Hva er et rekombinant DNA?

Mellom 1970- og 1980-tallet begynte molekylærbiologer å dra nytte av prosessene som naturlig forekommer inne i cellen og var i stand til å ekstrapolere dem til laboratoriet.

På denne måten kan et gen av animalsk opprinnelse (et virveldyr, for eksempel) settes inn i et segment av DNA fra en bakterie; eller DNA av en bakterie kan kombineres med et viralt DNA. Dermed kan vi definere et rekombinant DNA som et molekyl som består av DNA fra to forskjellige organismer.

Når dette hybrid- eller rekombinante molekylet er blitt til, uttrykkes genet av interesse. Med orduttrykket ønsker vi å referere til prosessen med oversettelse til protein.

Restriksjonsenzymer og ligaser: nøkkelen til prosessen

Et sentralt element i utviklingen av rekombinant DNA-teknologi var oppdagelsen av restriksjonsenzymer.

Dette er proteinmolekyler som viser evnen til å spalte DNA (nukleaser) i spesifikke sekvenser, og tjener som ”molekylsaks”. Fragmentene generert av disse enzymene kalles restriksjonsfragmenter.

Nevnte enzymer kan produsere symmetriske kutt i målsekvensen (i begge kjeder i samme høyde) eller asymmetriske kutt. Et sentralt aspekt ved virkningen av restriksjonsenzymer er at etter spaltningen av kjedene oppnås en "løs kant", komplementær til den andre kanten kuttet av det samme enzym.

Noen eksempler er ECOR 1 og Sma 1. For tiden er mer enn 200 typer restriksjonsenzymer kjent og kommersielt tilgjengelige.

For å være nyttig, må en saks være ledsaget av limet. Denne forseglingsvirkningen av DNA (tidligere behandlet med restriksjonsenzymer) utføres av ligaser.

Teknikk: hvordan er DNA fra en organisme kunstig modifisert i laboratoriet?

Nedenfor beskriver vi de viktigste trinnene som rekombinant DNA-teknologi krever. Alle utføres av fagpersoner i et molekylærbiologilaboratorium.

Hva er en "klon"?

Før vi fortsetter med den eksperimentelle protokollen, må vi merke oss at i molekylærbiologi og bioteknologi brukes uttrykket "klon" og verbet "klon" mye. Dette kan føre til forvirring.

I denne sammenheng viser vi ikke til kloning av en hel organisme (som for eksempel den berømte fåren Dolly), men til kloning av et stykke DNA, som kan være et gen. Det vil si å produsere mange eksemplarer - genetisk identiske - av sekvensen.

1. Isolering og oppnåelse av DNA

Det første trinnet er å bestemme hvilken sekvens du vil bruke. Dette avhenger helt av forskeren og målene for arbeidet hans. Dette DNAet må deretter isoleres og renses. Metodene og prosedyrene for å oppnå dette avhenger igjen av kroppen og vevet.

Generelt tas et stykke vev og underkastes behandling i en lysebuffer med proteinase K (et proteolytisk enzym) og deretter ekstraheres DNA. Deretter fragmenteres det genetiske materialet i små fragmenter.

2. Kloningsvektor

Etter de forberedende trinnene søker forskeren å introdusere DNA-segmentet av interesse i en kloningsvektor. Fra nå av vil vi kalle dette segmentet for hvitt DNA.

plasmider

En av de mest brukte vektorene i et plasmid av bakteriell opprinnelse. Et plasmid er et dobbeltstrenget, sirkulært DNA-molekyl som finnes naturlig i bakterier. De er fremmed for bakteriekromosomet - det vil si at de er ekstrakromosomale, og finnes naturlig i disse prokaryotene.

De grunnleggende elementene i en vektor er: (a) et replikasjonsorigin, som tillater DNA-syntese; (b) seleksjonsmiddel, som gjør det mulig å identifisere organismer som bærer plasmidet med mål-DNA, så som resistens mot noe antibiotikum; og (c) multikloningssete, der sekvensene som vil bli gjenkjent av restriksjonsenzymene, er funnet.

Det første vellykkede rekombinante DNA på laboratoriet ble klonet inn i plasmidet pSC101 fra bakterien E. coli. Dette inneholder et restriksjonssete for restriksjonsenzymet EcoRI og et gen for resistens mot et antibiotikum, i tillegg til replikasjonsoriginet.

Innføringen av mål-DNA i plasmidet utføres ved bruk av molekylære verktøy for restriksjonsenzymer og ligaser beskrevet i forrige seksjon.

Gjenværende vektortyper

I tillegg til plasmider, kan DNA settes inn i en annen vektor, for eksempel bakteriofag lambda, kosmider, YAC (gjær-kunstige kromosomer), BAC (bakterielle kunstige kromosomer) og fagemider.

3. Innføring av rekombinant DNA

Når det rekombinante DNA-molekylet (gen av interesse i plasmidet eller annen vektor) er oppnådd, blir det introdusert i en vert eller vertsorganisme, som kan være en bakterie.

For å introdusere fremmed DNA i en bakterie, brukes en teknikk kalt bakterietransformasjon, der organismen blir utsatt for en behandling med toverdige kationer som gjør den mottagelig for DNA-opptak.

Metodologisk kan vi ikke garantere at 100% av bakteriene i kulturen vår effektivt har tatt opp det rekombinante DNA-molekylet. Det er her den delen av plasmidet som inneholder antibiotikaresistens spiller inn.

Dermed vil bakteriene som har tatt opp plasmidet være resistente mot et visst antibiotikum. For å velge dem vil det være nok å bruke nevnte antibiotikum og ta de overlevende.

4. "Høst" proteinet

Etter å ha valgt bakteriene med vårt rekombinante DNA, fortsetter vi å bruke vertens enzymatiske maskineri for å generere proteinproduktet av interesse. Når bakteriene reproduserer, blir plasmidet sendt videre til avkommet, så det går ikke tapt under deling.

Denne prosedyren bruker bakteriene som en slags protein "fabrikk". Senere vil vi se at det har vært en veldig relevant prosedyre i utviklingen av effektive medisinske behandlinger.

Når kulturen er klar og bakteriene har produsert store mengder protein, lyses eller forstyrres cellen. Det finnes et bredt spekter av biokjemiske teknikker som tillater rensing av proteiner i henhold til deres fysisk-kjemiske egenskaper.

I en annen eksperimentell sammenheng er det ikke sikkert at vi er interessert i å generere proteinet, men vi er heller interessert i å skaffe DNA-sekvensen per se. Hvis dette var tilfelle, ville plasmidet bli brukt til å lage flere kopier av fragmentet som interesserer oss for å ha nok av mål-DNA til å utføre de relevante eksperimentene.

applikasjoner

Rekombinant DNA-teknologi åpnet et uendelig antall muligheter innen molekylærbiologi, bioteknologi, medisin og andre relaterte områder. De mest fremragende bruksområdene er følgende.

Genetisk analyse

Den første applikasjonen er direkte relatert til molekylærbiologilaboratorier. Rekombinant DNA-teknologi gjør det mulig for forskere å forstå den normale funksjonen til gener, og de genererte proteiner kan brukes i videre forskning.

Legemiddelindustrien

Proteiner produsert ved bruk av den rekombinante DNA-prosedyren har anvendelser innen medisin. To veldig relevante eksempler på området er humant insulin og veksthormon, som brukes på pasienter som mangler dette proteinet.

Takket være rekombinant DNA kan disse proteiner genereres uten behov for å trekke dem ut fra et annet menneske, noe som representerer ytterligere metodiske komplikasjoner og helserisiko. Dette har bidratt til å forbedre livskvaliteten for utallige pasienter.

referanser

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologi 2. Grupo Redaksjonelle Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Cellen: en molekylær tilnærming (Vol. 10). Washington, DC: ASM press.
3. Devlin, TM (2004). Biokjemi: lærebok med kliniske applikasjoner. Jeg snudde meg.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Roll av rekombinant DNA-teknologi for å forbedre livet. International journal of genomics, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Patologisk anatomi. Elsevier Spania.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Introduksjon til mikrobiologi. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Humant insulin: DNA-teknologiens første medikament. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.