Den agar Simmons citrat er det et fast medium anvendes som biokjemiske identifikasjon testmikroorganismer, spesielt gram - negative bakterier. Det opprinnelige mediet ble opprettet av Koser i 1923.
Koser's Citrat-medium besto av en buljong som inneholdt natriumfosfat, ammoniumfosfat, monopotassiumfosfat, magnesiumsulfat og natriumcitrat.
A. Dehydrert Simmons Citrate Agar kommersielt medium B. Tilberedt Simmons Citrate Agar. Kilde: A. Foto tatt av MSc. Marielsa Gil B. Roto2esdios, fra Wikimedia Commons
Som det fremgår, er den eneste kilden til karbon i mediet sitrat, og av nitrogen er ammoniumfosfat, og proteiner og karbohydrater utelates som en kilde til disse elementene, de er ofte til stede i andre medier.
Derfor kan bakteriene som er inokulert i dette mediet bare reprodusere hvis den er i stand til å ta opp karbonet fra sitrat. Testen var positiv hvis det var turbiditet i mediet, men det hadde den ulempen at uspesifikk turbiditet kunne forekomme.
Dette problemet ble løst av Simmons ved å tilsette bromotymolblått og agar til Kosers opprinnelige formel. Selv om prinsippet er det samme, tolkes det annerledes.
Basis
Noen bakterier har evnen til å overleve i fravær av gjæring eller melkesyreproduksjon, og trenger å skaffe energi ved bruk av andre underlag. I denne testen er den eneste karbonkilden som tilbys citrat.
Bakterier som er i stand til å overleve under disse forhold, metaboliserer sitrat raskt i et alternativ til den tradisjonelle ruten ved å bruke trikarboksylsyresyklusen eller sitratgjæringssyklusen.
Katabolismen av sitrat av bakterier omfatter en enzymatisk mekanisme uten intervensjon av koenzym A. Dette enzymet er kjent under navnet sitricase (citrat oxaloacetate lyase) eller citrat desmolase. Reaksjonen krever tilstedeværelse av et divalent kation, som i så fall tilføres av magnesium.
Reaksjonen genererer oksaloacetat og pyruvat, som deretter gir opphav til organiske syrer midt i en alkalisk pH dannet ved bruk av nitrogenkilden. Disse organiske syrene brukes som en karbonkilde som genererer karbonater og bikarbonater, noe som ytterligere alkaliserer miljøet.
Såningsmodus
Simmons citratmedium skal inokuleres lett i fiskestjerne ved hjelp av en rett sløyfe eller nål og inkuberes i 24 timer ved 35-37 ° C. Etter tiden blir resultatene observert.
Såingen gjøres bare på overflaten av agaren. Ikke punktering.
Tolkning
Hvis mediet forblir den opprinnelige fargen (grønn) og det ikke er noen synlig vekst, er testen negativ, men hvis mediet blir blått, indikerer det tilstedeværelsen av alkaliske produkter, som blir oppdaget av pH-indikatoren. I dette tilfellet er testen positiv.
Citrat (+) og (-). Kilde: MSc. Marielsa gil
Dette skjer fordi hvis bakterien bruker karbonet i sitratet, er den også i stand til å ta nitrogenet av ammoniumfosfat som den frigjør ammoniakk, og alkaliserer mediet.
På den annen side, hvis vekst av bakteriene blir observert i mediet, men det ikke er noen fargeendring, må testen også anses som positiv, siden hvis det er vekst, betyr det at bakteriene var i stand til å bruke sitrat som en karbonkilde, selv om det ikke er noen endring i pH for øyeblikket (noen ganger kan det ta tid).
Hvis det er noen tvil i tolkningen av den endelige fargen, kan den sammenlignes med et ikke-inokulert sitratrør.
Forberedelse
Vei 24,2 g av det dehydrerte mediet i en liter vann. Bland og la den hvile i cirka 5 minutter. Avslutt med å løse opp mediet ved å varme opp i 1 eller to minutter, og rist ofte.
Hell 4 ml i prøverørene og autoklaver ved 121 ° C i 15 minutter. Når du forlater autoklaven, skrå deg ved hjelp av en støtte på en slik måte at agaren stivner i form av et fløytebib med liten blokk eller bunn og mer avfasning.
Den endelige pH for sitratmediet er 6,9 (grønn farge). Dette mediet er veldig følsomt for endringer i pH.
Ved pH 6 eller lavere blir mediet gult. Denne fargen er ikke observert i bakterietesten.
Og ved pH 7,6 eller over blir mediet dypt preussisk blått.
Bruk
Simmons Citrate Agar brukes til identifisering av visse mikroorganismer, spesielt baciller som tilhører Enterobacteriaceae-familien og andre ikke-glukosegjærende baciller.
Kilde: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
Siste tanker
Simmons citratmedium er en veldig delikat test, da falske positiver kan oppnås hvis visse feil blir gjort.
Den omsorgen som må tas er følgende:
podestoff
En veldig tykk eller belastet bakterieinokulum bør ikke lages, da det kan føre til at en coppery gul farge utvikler seg på såstedet, uten å påvirke resten av mediet, men det kan føre til å tro at det er vekst. Det betyr ikke positiviteten til testen.
Et tykt inokulum kan også gi en falsk positiv, fordi organiske forbindelser som er dannet i celleveggene til døende bakterier, kan frigjøre nok karbon og nitrogen til å snu pH-indikatoren.
Derfor er idealet å så ved å bruke nålen i stedet for platinahåndtaket, for å unngå å ta overflødig materiale.
sådd
På den annen side, når batteriet med biokjemiske tester for identifisering av den aktuelle mikroorganismen blir utsatt, er det viktig at sitratprøven er den første som blir inokulert, for å unngå overføring av proteiner eller karbohydrater fra et annet medium.
Under denne omstendigheten er det mulig å oppnå en falsk positiv, fordi noen av disse stoffene som introduseres ved en feiltakelse vil bli metabolisert og vil forårsake en endring i pH.
En annen måte å unngå overføring av stoffer er å brenne sløyfen godt og ta en ny inokulum mellom en test og en annen.
Forsiktighet må også tas når du berører kolonien for å utføre inokulatet, siden det bør unngås å dra en del av agaren fra kulturen bakteriene kommer fra, på grunn av det som er forklart ovenfor.
I denne forstand anbefaler Matsen, Sherris og Branson å fortynne inokulatet i fysiologisk løsning før inokulering av sitrattesten for å unngå overføring av andre karbonkilder.
Fargeintensitet
Det bør tas i betraktning at intensiteten på fargen som produseres når testen er positiv, kan variere i henhold til næringshuset.
I tillegg er det mikroorganismer som tester positive etter 24 timer, men det er andre stammer som krever 48 timer eller mer for å produsere en endring i pH.
referanser
- Mac Faddin J. (2003). Biokjemiske tester for identifisering av bakterier av klinisk betydning. 3. utg. Redaksjonell Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
- BD Laboratories. BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015. Tilgjengelig på: bd.com
- Britannia Laboratories. Simmons Citrate Agar. 2015. Tilgjengelig på: britanialab.com
- Valtek diagnoselaboratorier. Simmons Citrate Agar. 2016. Tilgjengelig på: andinamedica.com.