STANDARD AGAR BEAD: BASIS, KLARGJØRING OG BRUK - BIOLOGI - 2025

Den standard telle agar er et fast, ikke-selektivt kulturmedium, som er utformet for kvantifisering av den aerobe mikrobiologiske belastningen til stede i prøver av drikkevann, avløpsvann, melkedrikkevarer, blant andre matvarer. Dette mediet er også kjent som PCA-agar, for dets forkortelse på engelsk plate Count Agar. Den ble opprettet i 1953 av Buchbinder, Baris og Goldstein.

Standard teller agarmedium er sammensatt av gjærekstrakt, triptein, glukose, agar og destillert vann. Denne formuleringen inneholder grunnleggende ernæringselementer som tillater utvikling av den nåværende aerobe mikrobielle belastningen, ikke krevende.

Desimale fortynninger for telling av CFUer i standard agar-tellinger. Kilde: Quentin Geissmann

Siden mediet ikke inneholder hemmere, kan bakterier vokse uten begrensninger, noe som gjør det ideelt for generell kolonitelling. Imidlertid vil plakkkvantifiseringsteknikken ikke detektere alle bakterier som er til stede, men bare de som er i stand til å vokse under de miljøforhold som den såede standard teller agar er utsatt for.

I denne forstand prøver platekvantifiseringsteknikken generelt å bestemme mengden av bakterier av den aerobe mesofile typen, det vil si de som vokser ved temperaturer mellom 25 og 40 ° C, med en optimal veksttemperatur på 37 ° C. .

Denne bakteriegruppen er veldig viktig, fordi de fleste av de sykdomsfremkallende bakteriene for mennesker finnes der.

Det skal bemerkes at det noen ganger kan være interessant å kvantifisere mengden av psykrofile bakterier som er til stede i mat. Disse bakteriene er de som vokser ved lave temperaturer (<20 ° C) og er ansvarlige for at mat spaltes raskere, selv når den er nedkjølt.

På samme måte kan termofile bakterier, som utvikler seg i et område mellom 50 ° C til 80 ° C eller mer, være viktige i visse typer mat, for eksempel hermetikk.

Mikrobiell kvantifisering uttrykkes i kolonidannende enheter (CFU) per gram eller milliliter prøve.

Basis

Standard tellemedium er designet for å tillate suksessfull vekst av ikke-fastidiske aerobe bakterier, da gjærekstrakt, triptein og glukose gir de nødvendige næringsstoffene for god mikrobiell vekst.

På den annen side har mediet en lys farge og et gjennomsiktig utseende, og det er derfor det er ideelt for visualisering av kolonier som er utviklet ved den dype såmetoden (platehelling).

Det er også mulig å telle kolonier etter såningsmetoden Drigalski slikkepott.

Når mikrobiell belastning er høy, må desimalfortynninger av studieprøven gjøres for å kunne telle CFU-ene.

Det skal bemerkes at dette mediet er anbefalt av American Public Health Association (APHA) for telling av aerobe mesofiler.

Forberedelse

Vei 23,5 g av det dehydrerte mediet og oppløst i en liter destillert vann. For å løse opp fullstendig, bør blandingen varmes opp under omrøring ofte til den koker. Underfølgende trinn avhenger av såteknikken som skal brukes.

For helleplate-teknikken

Fordel ved å dosere 12 til 15 ml i prøverørene. Deretter steriliseres i en autoklav ved 121 ° C i 15 minutter. La stivne loddrett i form av en blokk. Oppbevares i kjøleskap inntil bruk.

Smelt pluggen når du skal bruke den. Når den er smeltet, oppbevar den i vannbad ved 44-47 ° C mens prøvene tilberedes.

For overflatesåing

Steriliser mediet i en autoklav ved 121 ° C og fordel deretter 20 ml i sterile petriskåler. La stivne, vende og oppbevare i kjøleskapet til bruk.

Temperplater før bruk. PH i mediet bør være 7,0 ± 0,2.

Bruk

Standard Count Agar brukes i den aerobe mesofile telleteknikken under mikrobiologisk analyse av vann og mat. Antallet aerobe mesofiler er nødvendig, siden det bestemmer hygienisk kvalitet på prøven som er undersøkt.

Bruken av denne teknikken (ved bruk av dette mediet) tillater makroskopisk visualisering av isolerte kolonier for deres kvantifisering.

Plate helleteknikk (dybde såing)

-Prosess

Teknikken består av følgende:

1) Homogeniser prøven for å fordele bakteriene til stede.

2) En innledende suspensjon blir laget i en steril flaske eller pose, med respekt for forholdet mellom 10 g eller 10 ml prøve i 90 ml fortynningsmiddel ( ^10-1 ).

3) Fra den opprinnelige suspensjonen blir de relevante desimalfortynninger laget, avhengig av prøvetype. Eks: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Fortynninger lages med peptonvann eller fosfatbuffer.

For å gjøre dette, ta 1 ml av den første suspensjon, og plassere den i 9 ml fortynningsmiddel, fortsetter fortynningene om nødvendig, nå tar 1 ml av den 10 ^-2 fortynning og så videre.

4) Ta 1 ml av hver fortynning og legg i tomme sterile petriskåler.

5) Tilsett til hver plate 12 til 15 ml standard tellende agar som tidligere er smeltet og satt ved 44 - 47 ° C.

6) Drei platene forsiktig for å fordele prøven jevn på agaren og la den stivne.

7) Vend platene og inkuber ved 37 ° C i aerobiose i 24 til 48 timer.

8) På slutten av tiden undersøkes platene og koloniene telles i fortynningen som tillater det. De platene som har mellom 30 og 300 CFU er valgt for tellingen.

Telling kan gjøres manuelt, eller du kan bruke tellerutstyret for kolonien.

Verdiene som er tillatt per ml prøve, kan variere fra land til land, avhengig av forskrifter som de er underlagt.

-Beregning av UFC

Den generelle beregningen gjøres ved hjelp av følgende formel:

Formel for generell beregning av kvantifisering av CFU-er. Kilde: National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). Mikrobiologisk analyse av mat, offisiell analysemetodikk, indikatormikroorganismer. 2014 bind 3. Tilgjengelig på: anmat.gov.ar

Uttrykk resultatene med 1 eller 2 sifre, multipliser med den aktuelle basen 10. Eksempel: hvis resultatet er 16 545, blir det avrundet basert på det tredje sifferet til 17 000 og det vil bli uttrykt som følger: 1,7 x 10 ⁴ . Hvis resultatet nå var 16 436, runde det til 16 000 og uttrykk 1,6 x 10 ⁴ .

Teknikk for såing av overflater

-Prosess

-Inokulært med 0,1 ml av den direkte prøven hvis den er flytende, initial suspensjon ^10-1 eller av fortløpende fortynninger 10 ^-2 , 10 ^-3 osv., I midten av en standard teller agarplate.

-Del prøven jevnt med en Drigalski-slikkepott eller en L-formet glassstav. La den hvile i 10 minutter.

-Vend platene og inkuber aerobt ved 37 ° C i 24 til 48 timer.

- Fortsett å telle koloniene, velg de platene som er i området mellom 20 - 250 CFU.

-Beregning av UFC

For beregningen brukes fortynningsfaktoren, som er den inverse. Tallet avrundes til 2 signifikante sifre (avrunding i henhold til den tredje siffer) og uttrykt i kraft av bunndelen 10. For eksempel, hvis 224 CFU telles i prøven uten fortynning (10 ^-1 ), 22 x 10 ¹ CFU er rapportert , men hvis tallet var 225, rapporteres 23 x 10 ¹ CFU.

Hvis 199 CFU blir talt i fortynningen ^10-3 , rapporteres 20 x 10 ⁴ CFU, men hvis 153 CFU telles i samme fortynning, rapporteres 15 x 10 ⁴ CFU.

QA

Standard tellekulturmedium kan evalueres ved bruk av kjente sertifiserte stammer, slik som: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 ATCC 12228, Shigella flex.

Hvis kulturmediet er under optimale forhold, forventes det tilfredsstillende vekst i alle tilfeller, bortsett fra L. fermentum, som kan ha et regelmessig utbytte.

For å evaluere steriliteten til kulturmediet, bør en eller to plater av hver forberedt sats (uten inokulering) inkuberes ved 37 ° C i aerobiosis i 24 timer. Etter denne tiden skal ingen vekst eller fargeendring observeres i mediet.

begrensninger

- Ikke smelt agar mer enn en gang.

-Det forberedte mediet kan vare i opptil 3 måneder så lenge det oppbevares i kjøleskap og beskyttet mot lys.

-Dette mediet er ikke egnet for krevende eller anaerobe mikroorganismer.

referanser

1. Nasjonal administrasjon av medisiner, mat og medisinsk teknologi (ANMAT). Mikrobiologisk analyse av mat, offisiell analysemetodikk, indikatormikroorganismer. 2014 bind 3. Tilgjengelig på: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA-teller teller Agar. 2009. Tilgjengelig på: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratories. Standard Method Agar (PCA) i henhold til APHA og ISO 4833. Tilgjengelig på: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Agar plate teller. 2015. Tilgjengelig på: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B og Velázquez O. 2009. Teknikker for mikrobiologisk analyse av matvarer. 2. utg. Fakultet for kjemi, UNAM. Mexico. Tilgjengelig på: depa.fquim.unam