Den EMB-agar er et selektivt og differensielt medium som brukes for fast kultur isolering av Gram negative bakterier, særlig de Enterobacteriaceae og andre Gram-negative bakterier lite krevende. Det er også kjent under forkortelsen EAM, som står for eosin-metylenblått.
Dette mediet ble opprettet av Holt-Harris og Teague i 1916. Det inneholder pepton, laktose, sukrose, dipotassiumfosfat, agar, eosin, metylenblått og vann. Det ligner veldig på MacConkey Agar, spesielt når du bruker Levines modifiserte EMB Agar, som ikke inneholder sukrose.
Metallisk glans av Escherichia coli på EMB-agar Kilde: Carmen Moreno González, fra Wikimedia Commons
Faktisk bestemmer hvert laboratorium om de skal jobbe med det ene eller det andre, siden de har samme funksjon, selv om de er biokjemisk forskjellige.
Den har til og med den samme ulempen som klassisk MacConkey-agar når det gjelder svermende produksjon av slekten Proteus. For å unngå dette fenomenet kan agarkonsentrasjonen derfor økes med opptil 5%.
Basis
selektiv
EMB-agar er subtil selektiv fordi den inneholder anilinfargestoffene (eosin og metylenblått), som fungerer som hemmere, og forhindrer vekst av de fleste Gram-positive bakterier og noen raske Gram-negative stenger.
Imidlertid har denne agaren den ulempen at noen Gram-positive bakterier kan motstå tilstedeværelsen av de hemmende stoffene og vokse som små fargeløse punktskolonier, som Enterococcus faecalis og noen Staphylococcus.
Visse gjær kan også vokse, for eksempel Candida albicans-komplekset, som vil gi veldig små rosa kolonier. Klamydosporer kan til og med utvikle seg fra denne gjæren hvis prøven er dypt frø.
Differensial
På den annen side er EMB-agar også et differensialmedium, siden disse fargestoffene sammen (eosin og metylenblått) har egenskapen til å danne et bunnfall ved sur pH, og derfor tjener de som indikatorer for dens produksjon.
Dermed produserer svakt laktose- eller sukrosegjærende bakterier lilla kolonier innen 24 til 48 timer. For eksempel slektene Klebsiella, Enterobacter og Serratia.
De bakteriene som sterkt gjærer laktose, slik som Escherichia coli, eller sukrose, slik som Yersinia enterocolitica eller Proteus penneri, danner et grønn-svart bunnfall, noe som gir et karakteristisk metallisk glansutseende hos disse artene.
Det skal bemerkes at hvis EMB-levine medium (uten sukrose) brukes, vil Yersinia enterocolitica og Proteus penneri produsere klare kolonier.
Bakterier som ikke gjærer laktose eller sukrose, næres av tilstedeværelsen av peptoner, som gir aminosyrene og nitrogenet som er nødvendig for bakterievekst, og produserer klare kolonier. For eksempel slektene Salmonella og Shigella, blant andre.
På samme måte er det viktig å merke seg at Acinetobacter-slekten kan presentere lavendelblå kolonier, selv om det ikke er en laktosegjæring eller sukrose, men har egenskapen å feste metylenblått på celleveggen. Dette kan også skje med andre oksidative bakterier.
Forberedelse
Det opprinnelige dehydratiserte mediet er lys beige i fargen.
For å fremstille dette dyrkningsmediet må 36 gram av det dehydrerte mediet veies og suspenderes i en kolbe som inneholder en liter destillert vann.
Etter å ha la blandingen hvile i 5 minutter, ta kolben til en varmekilde, bland den kraftig og konstant til den koker og løses helt opp.
Deretter må det allerede oppløste kulturmedium steriliseres ved å bruke autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter.
På slutten av tiden fjernes den fra autoklaven og lar den stå kort. Deretter serveres fortsatt varm (45-50 ° C) 15-20 ml agar i hver steril petriskål. Mediumet skal være lakmusblått.
Etter servering lar platene stå litt avdekket til agaren avkjøles litt. De blir deretter tildekket og tillatt å stivne fullstendig. Deretter ordnes de i omvendte plateholdere og oppbevares i kjøleskap (8 ° C) til bruk.
Denne prosedyren utføres fortrinnsvis i en laminær strømningshette eller foran en Bunsen-brenner for å unngå forurensning.
Det er viktig å huske på at hvert kommersielt hus vil indikere mengden som skal veies for å tilberede kulturmediet.
Den endelige pH for mediet må være 7,2 ± 0,2
applikasjoner
Dette mediet brukes til å så urin og avføring eller en hvilken som helst type klinisk prøve, spesielt hvis det er mistanke om tilstedeværelse av ikke-snevende gram-negative baciller, som baciller som tilhører Enterobacteriaceae-familien, som vokser veldig godt på dette mediet.
Enteropatogene bakterier fra Shigella- og Salmonella-slektene kjennetegnes ved deres fargeløse eller svakt gule kolonier.
Andre ikke-laktosegjærende baciller som blant annet Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter, vokser også.
På samme måte er dette mediet veldig nyttig i den mikrobiologiske analysen av mat og vann, da det er ideelt for den komplette bekreftende fasen for bestemmelse av coliforms, det vil si å bekrefte tilstedeværelsen av E. coli fra grumsete EC-buljonger fra av den mest sannsynlige tallteknikken (MPN).
QA
For å verifisere at det nylagde kulturmediet fungerer bra, kan kontrollstammer plantes for å observere kolonienes egenskaper og kontrollere at de gir som forventet.
For dette kan ATCC-stammer eller godt identifiserte stammer av E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa og noen Gram-positive bakterier, som S. aureus, brukes.
E. coli forventes å generere godt utviklede blå-svarte kolonier med en grønn metallisk glans. Mens Enterobacter aerogenes og Klebsiella sp bør gi velutviklede blå-svarte slimkolonier.
På den annen side, Salmonella typhimurium og Shigella flexneri, må utvikle store kolonier, fargeløs eller med en svak ravfarge.
Til slutt vokser slekten Pseudomonas aeruginosa som fargeløse kolonier av uregelmessig størrelse, mens Gram-positive bakterier bør hemmes totalt eller vokse spredt med veldig små kolonier.
Siste tanker
Noen ganger gjør sterilisering at metylenblått reduseres, og viser en middels oransje farge. For at metylenblått skal oksidere og gjenvinne den lilla fargen, må den blandes forsiktig til fargen er utvunnet.
Etter sterilisering kan fargestoffet også falle ut, så det bør blandes godt før du serverer petriskålene.
referanser
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B og Velázquez O. 2009. Teknikker for mikrobiologisk analyse av matvarer. 2. utg. Fakultet for kjemi, UNAM. Mexico.
- Carranza C, León R, Falcón N, Neumann A, Kromm C. Karakterisering og distribusjon av potensielt patogene Escherichia coli-stammer isolert fra slaktekyllinger fra fjørfefarm i Peru. Pastor investiga. veterinæren. Peru 2012 23 (2): 209-219. Tilgjengelig på: scielo.org.
- Laboratorios Conda SA Eosin og Methylene Blue Agar. 2010. Tilgjengelig på: condalab.com
- Britannia Laboratories. Levine EMB (With Eosin and Methylene Blue) 2011. Tilgjengelig på: britanialab.com
- BD Laboratories. BD EMB Agar (Eosin Methylene Blue Agar), modifisert. 2013. Tilgjengelig på: bd.com
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. utg.). Argentina, Redaksjonelt Panamericana SA
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 utg. Argentina. Redaksjonell Panamericana SA