MÜELLER HINTON AGAR: BASIS, FORBEREDELSE OG BRUK - BIOLOGI - 2026

Den Mueller Hinton-agar er ikke selektiv, fast næringsmediet er sammensatt av kjøtt infusjon, pepton surt kasein, stivelse, agar og destillert vann. Dette mediet tillater utmerket mikrobiell vekst for de fleste raskt voksende bakterier.

Det ble opprinnelig opprettet av John Howard Müeller og Jane Hinton for å isolere ernæringsmessige krevende bakterier som Neisseria gonorrhoeae og Neisseria meningitidis. På grunn av dens egenskaper viste det seg imidlertid å være ideelt for undersøkelse av mottakelighet for antibiotika, noe som ga pålitelige og reproduserbare resultater.

Antibiogrammer (Müeller Hinton agar). Kilde: Dr Graham Beards på en.wikipedia

Derfor er Müeller Hinton agar kulturmediet som er akseptert av Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) og European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, for utførelse av den antimikrobielle mottakelighetstesten ved Kirby disk diffusjonsmetode og Bauer.

Basis

Å være et ikke-selektivt næringsmedium, det er utmerket for vekst av de fleste sykdomsfremkallende bakterier.

På den annen side gjør dens enkle sammensetning at stoffene lett diffunderer på dem, og er et essensielt kjennetegn for mottakelighetstesten ved diskdiffusjonsmetoden.

En annen av dens egenskaper er at den inneholder en liten mengde hemmere, som gjør det mulig å evaluere sulfonamider, trimetoprim og tetracykliner effektivt.

Det må imidlertid tas i betraktning at mediet må oppfylle visse betingelser for å sikre at det fungerer, inkludert:

Justering av pH, dybden av agaren og passende konsentrasjon av timin, tymidin, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ og Zn ⁺⁺ .

Du må også vite at metodikken er standardisert og at alle parametrene må oppfylles, for eksempel:

Konsentrasjonen av inokulatet, konsentrasjonen og konserveringen av antibiotikaskivene, plassering av passende antall plater på agaren, avstanden mellom en plate og en annen, den strategiske plasseringen av visse antibiotika, atmosfæren, temperaturen og tiden til inkubasjon.

Forberedelse

Vei ut 37 g dehydrert Müeller Hinton-medium og oppløs i 1 liter destillert vann. Varm opp mediet under omrøring for å hjelpe til med oppløsningen. Kok i 1 minutt.

Autoklaver for å sterilisere ved 121 ° C i 15 minutter. Når du fjerner fra autoklaven, bør kolben legges i et vannbad ved 50 ° C for å avkjøle. Hell 25 til 30 ml i sterile petriskåler med 10 cm diameter.

Platene skal ha en gjennomsnittlig tykkelse på 4 mm (ideell), med et område på 3-5 mm.

Hvis det er ønskelig å tilberede blodagar ved bruk av Müeller Hinton agar som base, hell 5% sterilt og defibrinert lammeblod før servering på tallerkenene.

Den endelige pH for mediet bør være mellom 7,2 og 7,4.

Invester og oppbevar i kjøleskap inntil bruk. La platen komme til romtemperatur før bruk.

Fargen på det tilberedte mediet er lys beige.

applikasjoner

Det brukes til å utføre antibiogram eller antibiotikasensitivitetstest for de fleste hurtigvoksende ikke-krevende patogener.

Hvis agaren er supplert med blod, brukes den til å utføre antiogrammet til krevende mikroorganismer som: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, blant andre. Det har også blitt brukt til å isolere Legionella pneumophila.

Antibiogram teknikk

Før du utfører antibiogrammet, må det utarbeides en bakterieløsning som tilsvarer 1,5 x ¹⁰⁸ celler.

For dette tas 3 til 4 kolonier av den rene kulturen og suspenderes i en soyabønne tryptikase-buljong eller i Müeller Hinton-buljong, inkuberes i 2 til 6 timer, og konsentrasjonen justeres med steril saltoppløsning, sammenlignes den med en Mac Farland-standard på 0,5%.

Hvis de etterspør mikroorganismer, kan kolonier suspenderes direkte opp til en konsentrasjon på 0,5% Mac Farland. Deretter podes Müeller Hinton-platen med en vattpinne impregnert med den tilberedte bakterieoppløsningen.

For å gjøre dette, blir vattpinnen nedsenket i løsningen og deretter blir overflødig væske fjernet ved å trykke mot veggene i røret. Umiddelbart etterpå føres vattpinnen over hele overflaten, og etterlater ingen steder urørt, deretter roteres platen litt og den blir sådd igjen. Operasjonen gjentas ytterligere 2 ganger.

La stå i 10 minutter og sett deretter inn antibiotikaskivene med en steril tang, slik at det er et gap på 24 mm mellom dem. Etter at du har lagt hver plate på agaren, trykker du lett på hver plate med pinsetten for å sikre at de fester seg godt.

Når prosessen er ferdig, blir platen invertert og inkubert ved 35-37 ° C i aerobiose i 16 til 18 timer. Hvis det er en krevende mikroorganisme, kan det fortjenes mikroaerofili, og hvis antibiogrammet inneholder oxacillin-plater, bør det leses etter 24 timer.

En linjal brukes til å måle diameteren på hver glorie. Resultatene skal registreres i mm. Deretter korreleres verdiene som er oppnådd med tabellene for avskjæringspunkter publisert i den gjeldende CLSI-manualen.

Måling av hemmende glorie. Kilde: USCDCP, Pixnio.com

Rapporter som sensitiv (S), mellomliggende (I) eller motstandsdyktig (R), som tilfellet er.

Antibiotika velges i henhold til den isolerte mikroorganismen og infeksjonstypen den produserer.

Noen ganger må man huske på den strategiske plasseringen av antibiotika for å avdekke fenotypiske resistensmønstre.

Strategisk plateplassering på Müeller Hinton agar

For enterobakterier bør clavulansyreskiven plasseres mot 3. og 4. generasjon cefalosporiner. En eggformet utvidelse indikerer at stammen er produsent av beta-laktamaser med utvidet spektrum (ESBL). Dette betyr at pasienten ikke skal behandles med noen kefalosporiner.

Fenotypisk uttrykk for utvidet spektrum beta-laktamase (ESBL) -produksjon i en Escherichia coli-stamme. Kilde: Foto tatt av forfatteren MSc. Marielsa gil

I Staphylococcus er det viktig å plassere erytromycin eller azithromycin-plate foran clindamycin-disken (D-test).

En resistent halo i erytromycin og en utflating i clindamycin-glorie indikerer at stammen har belastningsindusierbar klindamycinresistens (ICR). Dette betyr at en klindamycinbehandling ikke vil være effektiv.

For å søke etter inducerbare AMP C-stammer i Enterobacteriaceae og noen ikke-fermenterende gramnegative stenger, står tazobactan ceftazidime, cefoxitin eller piperacillin-plater mot en imipenem-plate, i en avstand på 27 mm.

En utflatet glorie på en av diskene mot imipenem indikerer tilstedeværelsen av inducerbar AMP C.

For letingen etter konstitutiv C-AMP blir en 500 ug cloxacillin-plate møtt med ceftazidim (30 ug) og med cefotaxime (30 ug), i en avstand på 25 mm. En utvidet glorie i noen av kefalosporinene indikerer positivitet.

Cloxacillin-disken kan også erstattes med en 9 mm plate av Whatman No. 6-filterpapir impregnert med fenylborsyre (400 ug) med en avstand på 18 mm. Det tolkes på samme måte som den forrige.

Til slutt, for å undersøke produksjonen av metallobetalaktamaser spesielt i Pseudomonas aeruginosa, brukes en plate impregnert med 10 ul etylendiaminetetraeddiksyre (EDTA 750 ug) og tioglykolsyre (SMA 300 ug), som blir konfrontert med imipenem- og meropenem-skivene, i en avstand på 15 mm.

Testen er positiv hvis det utvides imipenem- eller meropenem-glorieene mot EDTA / SMA-disken. Dette resultatet må bekreftes ved den modifiserte Hodge-testen.

Denne metoden består i å inokulere en Escherichia coli ATCC 25922 stamme på Müeller Hinton-platen. En imipenem-plate plasseres i midten av platen og deretter lages det en strek fra disken til periferien med den mistenkte P. aeruginosa-stammen. Opptil 4 stammer kan testes per plate.

Testen vil være positiv hvis det er en sone for forvrengning av imipenem-glorie rundt strekkmerket.

Årsaker til feilaktige resultater

- Dårlig konserverte antibiotiske plater kan gi falsk resistens. For eksempel er oksacillindisken veldig sårbar for temperaturendringer.

-En pH i mediet under det som er indikert (surt) produserer mindre glorier i aminoglykosider og makrolider (risiko for falsk resistens), og større glorier i penicillin, tetracyklin og novobiocin (risiko for falsk følsomhet).

-Hvis pH er over det som er indikert (alkalisk) er effektene beskrevet ovenfor reversert.

-Media med høye tymin- og tymidinkonsentrasjoner har innflytelse ved å redusere hemmingshaloene til sulfonamider og trimetoprim betydelig.

-Høye konsentrasjoner av kalsium og magnesium gir falsk motstand av aminoglykosider, polymyxin B og tetracykliner mot stammer av Pseudomonas aeruginosa.

-Lave konsentrasjoner av kalsium og magnesium gir falske følsomheter av aminoglykosider, polymyxin B og tetracykliner mot stammer av Pseudomonas aeruginosa.

-Tilstedeværelsen av sink påvirker resultatene av karbapenemskiver (imipenem, meropenem og ertapenem).

-Tykke på mediet under 3 mm vil gi falske følsomhetsresultater, mens tykkelse over 5 vil gi falsk motstand.

-Mobiliseringen av plater i antibiogrammet vil gi deformerte glorie, siden utslipp av antibiotika er øyeblikkelig.

- Svært svake inokulater påvirker resultatene, siden det ikke vil være en ensartet eller sammenflytende vekst i agaren, en nødvendig betingelse for å kunne måle hemmende glorie, i tillegg til at glorie kan gi større enn normalt.

-Overbelastede inokler kan gi glorie mindre enn normalt.

-Ikke å respektere avstanden mellom platene får en glorie overlapping med en annen, og de kan ikke leses riktig.

-Inkubat med CO ₂ øker størrelsen på gloriene på tetracyklin- og meticillin-skivene.

-Inkubat ved temperaturer under 35 ° C gir større glorie.

-Tilskudd av blod reduserer størrelsen på sulfa-halogen.

begrensning

Følsomheten for et antibiotikum demonstrert i antiogrammet mot en mikroorganisme (in vitro) er ikke en garanti for at det vil fungere in vivo.

QA

For å vite om mediet inneholder tilstrekkelig mengde tymin, må en stamme av Enterococcus faecalis ATCC 29212 plantes og følsomheten for trimethoprim sulfamethoxazole (SXT) må testes, den må gi en glorie som er lik eller> 20 mm for å være tilfredsstillende.

referanser

1. "Müller-Hinton-agar." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 16 nov 2018, 12:23 UTC. 27. januar 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Betingelser for en god mottakelighetsundersøkelse ved agar-diffusjonstest. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratory. Müeller Hinton agar med 5% fåreblod. 2009. Tilgjengelig på: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratory. 2017. Tilgjengelig på: .bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hinton agar. 2015. Tilgjengelig på: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. betalaktamaser av AmpC-type: Generaliteter og metoder for fenotypisk deteksjon. Pastor Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Tilgjengelig på: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypisk deteksjon av metallobetalaktamaser i kliniske isolater av Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Tilgjengelig på: scielo.org.