BIURET: BEGRUNNELSE, REAGENSER, PROSEDYRE, BRUK - BIOLOGI - 2025

Den biuret er et reagens anvendt for proteinbestemmelse langkjedet og kortkjedet. Det brukes spesielt innen analytisk kjemi og urinalyse for å undersøke konsentrasjonen av totale proteiner i serum, plasma og urin.

Proteinverdier kan økes eller reduseres i visse patologier. Hypoproteinemia-symptomer forekommer vanligvis hos pasienter med nyresykdom, hos underernærte pasienter og hos pasienter med kroniske infeksjoner.

Kjemisk struktur av komplekset dannet i Biuret-reaksjonen Positiv Biuret-test. Kilde: Yikrazuul / flickr

Mens hyperproteinemi observeres i patologier som multippelt myelom, systemisk lupus erythematosus, bakteriell endokarditt, bakteriell hjernehinnebetennelse, Waldenstroms makroglobulinemi, blant andre.

På den annen side skyldes tilstedeværelsen av protein i urinen filtrering av albumin ved nyrene. Dette er patologisk atferd som må studeres.

I denne forstand er Biuret veldig nyttig, siden den gjør det mulig å kvantifisere tilstedeværelsen av proteiner i serum, plasma, urin, blant mange andre prøver.

Til og med Biuret kan brukes til å undersøke tilstedeværelsen og konsentrasjonen av proteiner i dårlige undersøkte prøver eller prøver med ukjent sammensetning. Derfor er det mye brukt på forskningsområdet.

Biuret-testen er basert på påvisning av peptidbindinger. Testen foregår i et alkalisk medium. Prøven må inneholde minst to peptidbindinger for et fiolett-lilla kompleks å danne. Komplekset dannes av foreningen av bindinger og kobberion.

Basis

Biurets reagens er sammensatt av kaliumhydroksyd, kumprinsulfat og natrium- og kaliumtartrat. Natriumhydroksyd brukes til å alkalisere mediet, siden denne tilstanden er viktig for at reaksjonen skal finne sted.

Stoffene som reagerer med proteiner er kobbersulfat, mens natriumtartrat har den funksjonen å ikke tillate dannelse av kobberhydroksyd, som har en tendens til å utfelle og forstyrrer reaksjonen.

Hvis det finnes stoffer med peptidbindinger (polypeptider eller proteiner) i prøven, vil testen være positiv.

En reaksjon tolkes som positiv når løsningen blir lilla. Fargen produseres ved dannelse av et kompleks mellom minst to peptidbindinger som har CO-NH-gruppen og cupric-kationene.

Det fiolette komplekset kan dannes på to måter: den ene er ved tap av protoner fra amidgruppene som binder seg til metallet (depronotasjon), og den andre ved forening av oksygen- og nitrogenelektronene som er frie og binder. med kobber.

Denne reaksjonen kan variere i intensitet og farge avhengig av proteintype.

Testen kan utføres kvalitativt eller kvantitativt. I den kvalitative formen rapporteres det som positivt eller negativt. Mens den er i kvantitativ form, kan konsentrasjonen måles ved hjelp av den spektrofotometriske metoden.

Reaksjonen leses mellom 540-560 nm. Fargenes intensitet er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av peptidbindinger i prøven.

reagenser

-20% natriumhydroksyd (NaOH)

-Cupric sulfatpentahydrat 1% (CuSO _4. 5 H ₂ O)

-Blandet natrium- og kaliumtartrattethydrat (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Biuret reagensstabilitet

-Det må holdes nedkjølt.

Prosess

Teknikk

-Sett 100 ul prøven eller standarden som skal analyseres i et prøverør.

- Tilsett 2 ml natriumhydroksyd.

-Mix veldig bra.

- Tilsett 5 ml Biuret-reagens.

-Miks og la hvile i 25 minutter ved romtemperatur, dekk til og beskytt mot lys.

-Besøk formasjonen eller ikke av farger og måle spektrofotometrisk.

Kalibreringskurve

Bovint serumalbumin kan brukes som standard for å utføre kalibreringskurven. Ulike konsentrasjoner fremstilles ut fra det. For eksempel 25, 50, 75, 100, 125 og 150%.

Reaksjonen settes opp med alle disse kjente konsentrasjoner, og absorbansen avleses ved en bølgelengde på 540 nm. Med dataene om de kjente konsentrasjoner og absorbansavlesningene blir kalibreringskurven laget.

Ved hver bestemmelse eller batch av behandlede prøver anbefales det å montere en standard. Bovint serumalbumin 0,1-2 mg / ml kan brukes som en kalibreringsstandard.

Målinger gjøres på et spektrofotometer ved 540 nm.

Linearitet blir oppfylt opp til en konsentrasjon på 12 g / dl.

Innblanding

Stoffer som forstyrrer Biuret-testen

Selv om det ikke er veldig hyppig, må det bemerkes at noen stoffer kan forstyrre under utførelsen av denne testen. For eksempel kan tilstedeværelsen av ammoniakk hemme fargedannelse.

På samme måte kan andre stoffer absorbere i samme bølgelengde, for eksempel visse pigmenter.

På den annen side kan interferens genereres når et annet stoff enn peptidbindingen danner et kompleks med det kobberiske saltet. Eksempel: noen karbohydrater og visse lipider.

I tilfelle prøven som skal analyseres presenterer en eller annen type bunnfall, må den filtreres eller sentrifugeres før testen monteres.

Stoffer som ikke forstyrrer Biuret-testen

Testen påvirkes ikke av tilstedeværelsen av:

-Bilirubin opp til en konsentrasjon på 20 mg / dl.

-Hemoglobin opp til en konsentrasjon på 750 mg / dl.

-Extran opp til en konsentrasjon på 30 g / L

-Triglyserider opp til en konsentrasjon på 4000 mg / dl.

Fordel

-Det er en enkel metode å utføre.

-Det er en økonomisk test.

-Det har høy spesifisitet for proteiner.

-Litt interferens.

ulemper

Det har dårlig følsomhet for å oppdage lave mengder protein. Arbeidet som ble utført av Fuentes et al. Bekrefter at Biuret-testmetoden har en deteksjonsgrense på 1 mg / ml protein og en kvantifiseringsgrense på 3 mg / ml.

Imidlertid rapporterer annen forskning utført ved University of Amazonia mye lavere verdier. Deteksjonsgrensen rapportert av studien er 0,020 mg / ml og kvantifiseringsgrensen er 1,33 mg / ml.

applikasjoner

Biuret-reagenset eller testen brukes til bestemmelse av proteiner i kliniske og ikke-kliniske prøver i rutine- og forskningslaboratorier.

Patologier som oppstår med en økning eller nedgang i

I mange patologier er det viktig å bestemme konsentrasjonen av totale proteiner i kliniske prøver, som kan være forhøyet eller redusert.

De er forhøyet i:

-Multippelt myelom,

-Systemisk lupus erythematosus,

-Bakteriell endokarditt,

-Bakteriell hjernehinnebetennelse,

Waldenstroms makroglobulinemi, blant andre.

Det reduseres i:

-Nedsatt mangel,

-Personer med alvorlig grad av underernæring,

-Pasienter med kroniske infeksjoner, blant andre.

Kliniske prøver

De vanligste kliniske prøvene er serum, plasma og urin. Den normale verdien av proteiner i serum eller plasma er 6,0-8,8 gr / dl.

Konsentrasjonen av proteiner i urinen hos voksne overstiger ikke tallet 150 mg / 24 timer.

Urinprotein / urin kreatininforhold normal verdi

Spedbarn: <0,50 mg

Barn 2 år og eldre: indeks: 0,20 mg

Voksne: <0,2 mg

Ikke-kliniske prøver

Biuret-reaksjonen kan brukes til mange typer ikke-kliniske prøver, for eksempel meieriprodukter, antivenom eller et hvilket som helst ukjent stoff du vil undersøke tilstedeværelsen av proteiner for.

referanser

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). Fysisk-kjemisk karakterisering og proteininnhold i væskeekstrakter av mangroveoksen (Crassostrearizophorae). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66-74. Hentet 26. juni 2019, fra http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Funksjonell karakterisering av mandelen til mangofrø (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67-75
3. "Biuret." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 19. juni 2019, 16:37 UTC. 26. juni 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Standardisering av Biuret-metoden for å kvantifisere totale proteiner i polyvalent antibotropisk serum produsert ved INS nasjonale senter for biologiske produkter. Bol - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). Tilgjengelig på: repositorio.ins.gob.pe
5. Vinprodusentlaboratorier. Totalt proteiner. Kolorimetrisk metode for bestemmelse av totale proteiner i serum og plasma. Tilgjengelig på: wiener-lab.com.ar