- Basis
- Forberedelse
- applikasjoner
- sputum
- Mageskylling, bronkialskylling og bronkialaspirat
- Urin
- Ascites væske, pleural væske, cerebrospinal væske
- biopsier
- Laryngeal vattpinne
- sådd
- inkubasjon
- QA
- begrensninger
- Referanse
Den Löwenstein-Jensen medium er et selektivt fast medium for isolering og utvikling av bakterier av slekten Mycobacterium, slik som Mycobacterium tuberculosis, M. avium, blant andre, med unntak av leprae art, som er ikke dyrkbare.
Bakterier av slekten Mycobacterium vokser ikke i konvensjonelle kulturmedier, derfor var det nødvendig å utforme et spesielt medium for deres isolasjon. Det opprinnelige mediet ble opprettet av Löwenstein og senere modifisert av Jensen.
Löwenstein-Jensen medium med kolonier av Mycobacterium tuberculosis. Kilde: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., med tillatelse av Biologibildebiblioteket
Modifiseringen bestod i eliminering av Kongo-røde fargestoff, og erstattet den med en høyere konsentrasjon malakittgrønt. Det endret også konsentrasjonene av magnesiumcitrat og monopotassium fosfat.
Löwenstein-Jensen-medium inneholder for tiden potetstivelse, asparagin, magnesiumsitrat, monopotassiumfosfat, magnesiumsulfat, malakittgrønn, nalidiksinsyre, cykloheksimid, lincomycin, bankede egg, glyserin og vann.
Mycobacteria er normalt isolert fra steder som ikke er sterile, som sputum, urin, abscesser, blant andre. Dette betyr at de fleste av prøvene vil inneholde den vanlige mikrobiotaen i området, pluss patogenet.
Det er grunnen til at Löwenstein-Jensen-mediet inneholder en serie av hemmere i sin sammensetning representert av malakittgrønt, antibiotika og soppdrepende midler.
I tillegg må prøver som kommer fra ikke-sterile steder dekontamineres og nøytraliseres før de blir sådd i Löwenstein-Jensen-mediet.
Basis
Tilstedeværelsen av egg og glyserin i Löwenstein-Jensen-mediet stimulerer veksten av mykobakterier fordi de gir fettsyrene og proteiner som er nødvendige for utviklingen av disse mikroorganismer.
Löwenstein-Jensen-medium inneholder malakittgrønt, som er en hemmer av den medfølgende mikrobiota. Men den inneholder også nalidixinsyre (35 µg / ml), som hemmer den Gram-negative mikrobiota, cycloheximide (400 µg / ml), som hemmer saprofytiske sopp og gjær, og lincomycin (2 µ / ml), som hemmer den Gram-positive mikrobiotaen.
Noen kommersielle hus foretrekker å legge til følgende kombinasjon av antibiotika: polymyxin B 200 000 enheter / l, amfoterisin B 10 mg / L, karbenicillin 50 mg / L og trimethoprim 10 mg / L.
Dette mediet inneholder ikke agar, derfor skjer størkningen av mediet på grunn av koagulering av albuminet som er tilstede i egget under sterilisering.
Forberedelse
Vei 37,3 g av det dehydrerte mediet i 600 ml destillert vann til hvilket 12 ml glyserol tidligere er tilsatt. Blandingen blir oppvarmet under omrøring ofte til den er helt oppløst. Autoklaver mediet ved 121 ° C i 15 minutter.
På den annen side bør en homogen suspensjon av 1000 ml ferske egg tilberedes under aseptiske forhold. Tilsett eggesuspensjonen til 600 ml medium tilberedt ved en temperatur på 50 - 60 ° C, unngå luftbobler.
Antibiotiske løsninger tilsettes også etter sterilisering i autoklaven.
Hell mediet i sterile skruekappede prøverør. Varm rørene ved 85 ° C i 45 minutter i skråstilling.
Fargen på det tilberedte mediet er akvamaringrønt og kan ha hvite flekker på grunn av tilstedeværelsen av egglipider.
PH i mediet må være 7,2 ± 0,2
Oppbevar rør i kjøleskap og beskyttet mot direkte lys til bruk. Temperert før såing.
Det er en modifikasjon av mediet kalt "Gruft modification of the Löwenstein Jensen". Denne inneholder de samme forbindelsene som det klassiske mediet, men RNA-5 mg / 100 ml tilsettes, og som hemmere inneholder den malakittgrønn 0,025 g / 100 ml, penicillin 50 U / ml og nalidiksinsyre 35 ug / ml.
applikasjoner
Löwenstein-Jensen medium brukes til isolering av mycobacteria fra forskjellige typer prøver. En Ziehl-Neelsen-flekk anbefales for alle eksempler der mistanke om tilstedeværelse av mykobakterier.
Noen prøver kommer fra sterile steder, men andre gjør det ikke. Ikke-sterile prøver må dekontamineres etter behov:
sputum
Sputumprøver skal dekontamineres som følger: bestem mengden av sputumprøven i ml og tilsett samme mengde 4% NaOH til prøven og inkuber ved 37 ° C.
Rist blandingen ofte i løpet av 30 minutter. Sentrifuger deretter ved 3000 o / min i 30 minutter.
Kast supernatanten over en fenolisk desinfiserende løsning. Bruk sedimentet til såing, men først må pH nøytraliseres.
For å nøytralisere sedimentet, brukes 5% H 2 SO 4 i nærvær av fenolrød indikator til den når en nøytral pH som forårsaker en laksefarge.
Mageskylling, bronkialskylling og bronkialaspirat
I dette tilfellet må prøven sentrifugeres ved 3000 o / min i 30 minutter. Supernatanten kastes og pelleten brukes. For å sanere sedimentet, tilsett 3 ml 4% NaOH og rør ofte ved 37 ° C i en periode på en halv time.
Sentrifuge igjen, supernatanten kastes og pelleten brukes. Det siste må nøytraliseres som forklart i sputumprøven.
Urin
La prøven sette seg i kjøleskapet i 24 timer. Skill supernatanten. Den gjenværende pelleten skal sentrifugeres i 30 minutter ved 3000 RMP. Kast supernatanten igjen og rekonstituer pelleten med 3 ml steril fysiologisk løsning.
Tilsett 3 ml 4% NaOH og fortsett med dekontaminering og nøytralisering som beskrevet før.
Ascites væske, pleural væske, cerebrospinal væske
I denne typen prøver sentrifugeres den og supernatanten kastes. Utfør et gram på sedimentet eller observer direkte under mikroskopet; Hvis bakterier ikke blir observert, er dekontamineringstrinnet ikke nødvendig, og heller ikke nøytraliseringstrinnet.
I dette tilfellet kan prøven sås direkte ved bruk av sedimentet. Hvis det er bakterier, fortsett med å rense og nøytralisere som beskrevet ovenfor.
biopsier
Til denne typen prøver må 5 ml destillert vann tilsettes til senere sentrifuge ved 1500 omdreininger / min i 10 minutter. Kast supernatanten og sentrifuger pelleten på nytt ved 3500 o / min i 30 minutter. Bruk sedimentet til å så kulturmediet.
Laryngeal vattpinne
Pinnen skal plasseres i et sterilt rør som inneholder like store deler av destillert vann og 4% NaOH. Pinnen må presses mot rørets vegger slik at prøven blir fortynnet i væsken. Sentrifuger og bruk sedimentet. Nøytraliser sedimentet som allerede beskrevet.
sådd
Löwenstein-Jensen-mediet inokuleres ved tilsetning av 0,5 ml av prøven på overflaten av mediet. Drei røret for å fordele prøven gjennom mediet. Ikke bruk platinahåndtak.
Et andre rør som inneholder Stonebrink-medium, kan sås for å isolere Mycobacterium bovis og andre arter som ikke vokser på Löwenstein-Jensen-medium.
inkubasjon
De inokulerte rørene inkuberes aerobt ved 37 ° C, med hetten litt løs og skrått ved omtrent 5 ° og beskyttet mot lys. Miljøet kan berikes med 5–10% karbondioksid. Sjekk kulturer to ganger i uken til kolonier dukker opp.
Når prøven er absorbert, strammes lokkene. Maksimal inkubasjonstid er 8 uker, hvis det etter denne tiden ikke er noen vekst, rapporteres det som negativt.
QA
Følgende stammer kan brukes som kvalitetskontroll:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus Coccoccoc 320 Coccoc 320
Det forventes utmerket utvikling for de tre første nevnte artene, for M. fortuitum-veksten skal være god, mens for M. bovis forventes det liten eller ingen vekst. I mellomtiden må andre arter enn slekten Mycobacterium hemmes fullt ut.
begrensninger
Det tilberedte mediet må beskyttes mot lys, langvarig eksponering for lys får mediet til å bli fra grønt til blått, i dette tilfellet kan mediet ikke lenger brukes. Dette fordi malakittgrønt er lysfølsomt.
Mediet, ettersom det inneholder egg, kan lett forurenses hvis det ikke håndteres aseptisk. Det kan løses hvis det blir forurenset med proteolytiske bakterier.
Dyrking og håndtering av bakterier av slekten Mycobacterium krever kvalifisert personell som er klar over biosikkerhetstiltakene som må følges for å unngå å bli forurenset eller forurense andre.
HCl skal ikke brukes i nøytraliseringstrinnet på grunn av dannelse av natriumklorid, som kan være giftig for Kochs bacillus.
Prøvene skal holdes nedkjølt og beskyttet mot lys mens de ikke behandles.
Referanse
- Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Löwenstein-Jensen selektivt medium. Tilgjengelig på: f-soria.es
- Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medium. Tilgjengelig på: britanialab.com.
- Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen medium. Tilgjengelig på: foodsafety.neogen.com.
- "Löwenstein-Jensen medium." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 20 nov 2018, 15:15 UTC. 24. april 2019, 18:34. wikipedia.org
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
- Mac Faddin J. (2003). Biokjemiske tester for identifisering av bakterier av klinisk betydning. 3. utg. Redaksjonell Panamericana. Buenos Aires. Argentina.