PROTEINASE K: KJENNETEGN, ENZYMATISK AKTIVITET, ANVENDELSER - BIOLOGI - 2026

Den K proteinase er et enzym som hører til gruppen av serinproteaser, det vil si, den har i sitt midt en katalytisk aktiv aminosyre som serin og har den funksjon å bryte peptidbindinger ved hydrolyse. Dette enzym tilhører i sin tur familien av subtilisinproteiner (peptidase S8).

Proteinase K har en molekylvekt (MW) på 28 900 dalton og ble isolert for første gang i 1974 i ekstrakter av soppen Engyodontium-album, tidligere kjent som Tritirachium-album Limber.

Molekylær struktur av proteinase K. Kilde: Lykchiniadis

Det har en høy proteolytisk kapasitet, demonstrert ved å være i stand til å nedbryte keratinet som er til stede i håret. Ordet keratin på engelsk er stavet "keratin", derav har det blitt kalt "proteinase K".

På grunn av sin høye kraft til å spalte naturlige proteiner, er dette enzymet nyttig i forskjellige molekylærbiologiske teknikker. Det brukes først og fremst til å isolere og tilberede nukleinsyrer med høy molekylvekt (MW).

Proteinase K virker ved å frigjøre kjernefysisk DNA, samtidig som proteiner ødelegges og inaktiverer RNaser og DNaser, det vil si at det eliminerer nukleaser i DNA- og RNA-preparater.

På den annen side har det blitt sett at proteinase K kan hydrolysere noen denaturerte naturlige proteiner, noe som har vakt forskernes interesse for deres bruk i studien av prionproteiner (PrPC).

Til tross for sin høye proteolytiske styrke, er det imidlertid proteiner som er resistente mot virkningen av proteinase K. Blant dem er noen unormale proteiner kalt prions (PrPSc), assosiert med overførbare spongiforme encefalopatier.

Proteinase K-egenskaper

Proteinase K har en tertiær struktur sammensatt av tre lag, med et syv-kjede β-ark anbrakt mellom to lag med helikser. Ettersom den tilhører S8-familien av peptidaser, er den preget av å ha en katalytisk triade i det aktive stedet, hvis sekvensielle rekkefølge er (Asp, His og Ser), som skiller dem fra andre familier av peptidaser.

Dette enzymet fra gruppen serinproteaser er karakterisert ved hydrolysering av peptidbindinger nær karboksylgruppen av alifatiske og aromatiske aminosyrer.

På den annen side er den i stand til å virke i nærvær av visse etsende stoffer, for eksempel natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCL og EDTA, som brukes til å hjelpe denaturering av proteiner, og får dem til å miste sin opprinnelige struktur.

Dette er et foreløpig trinn i å forberede proteiner for elektroforeseteknikken. PH-området hvor proteinase K virker, er ganske bredt (2,0 til 12,0), med en optimal pH mellom 7,5 og 12,0, og dets isoelektriske punkt er 8,9. Som det er sett, er det aktivt mot et veldig bredt pH-område.

Et annet kjennetegn som skiller seg ut i proteinase K er stabiliteten i nærvær av høye temperaturer (50 - 60 ° C).

Enzymatisk aktivitet

Proteinase K krever tilstedeværelse av kalsiumion, selv om dette ikke påvirker aktiviteten, hvis det er viktig for å opprettholde stabiliteten.

For at proteinase K skal fordøye underlaget fullstendig, er det nødvendig med en kontakttid på omtrent 5 minutter til 2 timer.

Imidlertid sammenlignet Daza et al. Renheten av DNA oppnådd ved forskjellige eksponeringstider mot proteinase K, og konkluderte imidlertid med at en langvarig inkubasjon (opptil 24 timer) forbedrer DNA-kvaliteten betydelig.

I forhold til konsentrasjonen av proteinase K-enzymet som brukes i de forskjellige protokollene, kan det imidlertid sies at det er veldig variert.

Det kan brukes fra veldig lave konsentrasjoner (5 ug / ml) til konsentrasjoner på 500 ug / ml. Men de vanligste arbeidskonsentrasjonene varierer fra 50–100μg / ml, spesielt for proteinfordøyelse og nukleaseaktivisering. Selv om det er behov for en konsentrasjon på 2 mg / ml for behandling av vev.

applikasjoner

Bruksområdene er veldig brede og kan oppsummeres som følger:

-Det brukes i fordøyelsen av proteiner og DNA-ekstraksjon ved forskjellige metoder som: salting ut, PK-SDS, cetyl-trimetylammoniumbromid (CTAB), modifisert kaliumacetat og ekstraksjon med natriumjodid.

-Inaktivering av nukleaser (RNaser og DNaser).

-I hybridisasjonsteknikk in situ (HIS), for å hjelpe frigjøring av nukleinsyre, i tillegg til å eliminere uønskede proteiner.

-Modifisering av proteiner.

-På forskningsnivå, i ulike studier.

Fordeler med proteinase K

Flere sammenlignende studier har blitt utført mellom DNA-ekstraksjonsteknikker som bruker Proteinase K, med andre som ikke bruker det, og alle konkluderer med at det er større fordeler ved bruk av enzymet. Fordelene inkluderer følgende:

-DNA oppnås med høy molekylvekt, av høy kvalitet og renhet.

-Det ekstraherte DNA er stabilt i opptil 3 måneder.

Det ekstraherte DNA kan brukes i følgende teknikker: Southern blot, polymerasekjedereaksjon (PCR), elektroforese, blant andre.

Proteinase K-resistente proteiner

Ulike undersøkelser har konkludert med at prioner (unormale toksiske PrPSc-proteiner) skiller seg fra PrPC (naturlige) proteiner ved å være resistente mot virkningen av proteinase K, mens PrPC-er er følsomme for virkningen.

Andre forfattere har beskrevet at det i strukturen til PrPSc er sensitive deler og andre som er resistente mot proteinase K. Imidlertid er begge deler like giftige og smittsomme.

På den annen side isolerte Bastian et al. I 1987 4 proteiner på 28, 30, 66 og 76 kda fra en art av Spiroplasma mirum. Alle viste seg å være resistente mot virkningen av proteinase K og hadde også en kryssreaksjon med noen prioner.

Det er kjent at denne arten kan forårsake grå stær og viktige nevrologiske skader, og på grunn av Bastians vitenskapelige funn, blant andre undersøkelser, er det gjort et forsøk på å knytte denne mikroorganismen til overførbare spongiforme encefalopatier.

Imidlertid tilskrives etiologien til denne degenerative nevrologiske patologien fortsatt til prioner i dag.

I denne forstand identifiserte og karakteriserte Butler et al. I 1991 en klasse proteinresistent mot proteinase K på 40 kda fra to stammer av Mycoplasma hyorhinis. Dette patogenet påvirker griser og infiserte vevene deres, men i dette tilfellet var det ingen kryssreaksjon med prioner som ble testet.

Mer forskning er nødvendig for å belyse mange ukjente i denne forbindelse.

referanser

1. Bastian F, Jennings R, og Gardner W. 1987. Antiserum mot scrapieassosiert fibrilprotein kryssreagerer med Spiroplasma miru m fibrilproteiner. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Evaluering av en DNA-ekstraksjons- og rensemetode fra formaldehydfestet muskelvev fra uidentifiserte kadavre. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, og Mcgarrity G. Identifisering og karakterisering av protein-K-motstandsdyktige proteiner i medlemmer av Class Mollicutes. Infeksjon og immunitet, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Sammenligning av to Trypanosoma cruzi DNA-ekstraksjonsprotokoller dyrket i aksenisk medium. Pastor Peru. Med. Exp. Public Health 2014; 31 (2): 222-227. Tilgjengelig på: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E og Palma W. Bestemmelse av effektiviteten til fem DNA-ekstraksjonsprotokoller fra parafinisert materiale for molekylære studier. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.