DNA-SEKVENSERING: MAXAM-GILBERT, METODE OG EKSEMPLER - BIOLOGI - 2026

Den DNA-sekvensering (deoksyribonukleinsyre) er en prosedyre i molekylærbiologiske laboratorier som gjør det mulig å vite rekkefølgen av nukleotider i det genetiske materialet av interesse. Videre kan sekvensering av RNA (ribonukleinsyre) også beskrives.

Denne teknikken har vært uunnværlig for utvikling av biologiske vitenskaper. Det er også aktuelt for andre kunnskapsfelt - for eksempel medisinsk diagnose og rettsmedisinske undersøkelser.

Kilde: pixabay.com

Tidligere ble sekvenseringen av en DNA-streng ansett som en langsom og kostbar aktivitet, noe som muliggjorde identifisering av bare noen få basepar i oligonukleotidene.

I dag, med alle fremskritt innen vitenskap, er DNA-sekvensering en rutinemessig operasjon i mange laboratorier over hele verden takket være bidraget fra nesten 50 års forskning på dette feltet. Når det gjelder kjedelengde, kan opptil millioner basepar partsekvenseres på veldig kort tid.

For å gjøre dette, er det dusinvis av teknikker utviklet som varierer i pris og presisjon. I denne artikkelen vil vi beskrive både klassiske og moderne teknikker, hver med sine fordeler og ulemper.

Inntil nå tillater sekvenseringsteknikker å oppnå sekvensen av komplette genomer, fra små prokaryoter og gjær til det menneskelige genom.

DNA-struktur

For å forstå metodene og teknikkene som brukes for DNA-sekvensering, er det nødvendig å kjenne til visse viktige aspekter av molekylets struktur og sammensetning.

DNA er et biomolekyl som finnes i alle levende ting, fra bakterier til store vannlevende dyr. Organeller - som mitokondrier og kloroplaster - har et sirkulært DNA-molekyl inni seg. Selv i noen virus er genetisk materiale funnet DNA.

Strukturelt er DNA en samling av nukleotider. Hver og en består av et karbohydrat, en nitrogenholdig base (A, T, C eller G) og en fosfatgruppe. Målet med DNA-sekvensering er å avsløre i hvilken rekkefølge de fire nitrogenholdige basene er funnet i sekvensen.

Historie

På midten av 1950-tallet beskrev forskerne Watson og Crick strukturen til DNA ved hjelp av kristolografiske teknikker. Ingen av disse forskerne hadde imidlertid klart å finne en måte å løsne sekvensen på.

Selv om det var visse forgjengere, var den viktigste begivenheten opprettelsen av Sanger-metoden, i 1977. Frederick Sanger, faren til metoden, var en britisk biokjemiker, vinner av to nobelpriser for sine enorme bidrag til biologiske vitenskaper.

Denne teknikken er også kjent i litteraturen som "kjedeavslutning" eller dideoxynukleotider. Prinsippene for denne teknikken og de som ble utviklet basert på forbedring og innovasjon vil bli beskrevet nedenfor.

Sanger-metoden

Utviklingen av Sanger-metoden representerte en avgjørende hendelse i molekylærbiologi. Det involverer de grunnleggende komponentene i DNA-replikasjonsprosessen som normalt forekommer i cellen, men tilfører en spesiell komponent: dideoxynukleotides.

Hovedkomponenter i reaksjonen

- DNA-polymerase: DNA-polymerase-enzymet er et viktig element i prosessen. Dette molekylet deltar i replikasjonen av DNA-strengen, og dets rolle er syntesen av den nye strengen, og kobler sammen trifosfatdeoksyribonukleotidene med de komplementære.

Husk at i DNA kobler tyminer (T) sammen med adeniner (A) gjennom to hydrogenbindinger, mens cytosin (C) gjør det med guanin (G) gjennom tre bindinger.

- Nukleotider: Sanger-sekvensering involverer to typer nukleotider, de fire 2'-deoksynukleotidene (forkortet dATP, dGTP, dCTP og dTTP) og de fire dideoxynukleotidene (ddATP, ddGTP, ddCTP og ddTTP).

Selv om dideoxynukleotider ligner monomerer som normalt er inkorporert i DNA, mangler de en -OH-gruppe i strukturen. Dette gjør det umulig å tilsette et nytt nukleotid til kjeden.

Derfor, når et spesielt nukleotid tilsettes - på en helt tilfeldig måte - til kjeden i formasjonen, blir syntesen lammet. På slutten av reaksjonen er det således kjeder i forskjellige størrelser, hver der reaksjonen ble stoppet på et annet punkt.

Eksperimentelt er fire tester utarbeidet. Hver inneholder DNA ekstrahert fra den biologiske prøven av interesse, de normale nukleotider og en av de fire spesielle nukleotidtyper. Enten er de spesielle nukleotidene merket med en type lysstoffrør (se automatisert sekvensering nedenfor).

Leser resultatene

Det første trinnet er å skille hver av de syntetiserte kjedene i henhold til deres størrelse. Noen vil være lengre enn andre, avhengig av hvor de spesielle basene ble innlemmet.

Det er forskjellige biokjemiske teknikker som tillater separasjon av komponentene i en blanding ved bruk av størrelse som en diskriminerende egenskap. I Sangers metode skilles de forskjellige kjedene ved elektroforese. I de mer sofistikerte variantene av teknikken brukes kapillærelektroforese.

Dermed reiser de lengre trådene mindre enn de kortere variantene. Dette systemet går deretter gjennom en leser som gjenkjenner markøren som er inkludert i hvert dideoxynukleotid. På denne måten kan rekkefølgen på sekvensen være kjent.

Denne "første generasjon" teknikken er i stand til å lese DNA-fragmenter som ikke er større enn 1 kilobase. For tiden brukes Sanger-metoden i forskjellige laboratorier, generelt i de moderne variantene. I tillegg brukes den til å bekrefte resultatene oppnådd med de mest komplekse teknikker - men mindre presise.

Automatisk sekvensering

Når det kreves sekvensering i stor skala, akselereres prosessen gjennom automatisering. Dette er en variant av Sanger-kjedetermineringsmetoden, der primerne er merket med lysstoffrør for å skille dem.

Deretter kjøres reaksjonsproduktet i en elektroforese - alt på en enkelt bane. Når hvert fragment kommer ut av den endelige delen av gelen, blir det raskt identifisert ved sin fluorescerende merking, med en feil rundt 1%.

De mest sofistikerte systemene har et system på opptil 96 kapillarrør som administreres av en datamaskin koblet til en robot. Det vil si at 96 DNA-prøver kan testes samtidig. Dermed er prosessen som involverer elektroforese og analyse av resultatene fullstendig automatisert.

På en dag kan disse systemene sekvensere opptil 550 000 baser. Under prosessen er menneskelig arbeid unødvendig, det tar bare 15 minutter å starte metoden.

Maxam-Gilbert-sekvensering

Samtidig som Sanger publiserte sitt arbeid, lyktes to forskere som het Allan Maxan og Walter Gilbert, med å utvikle en annen metode for å få tak i DNA-sekvensen. Metoden fikk popularitet på den tiden, men ble senere fortrengt av forbedringen av Sangers metode.

I motsetning til Sanger-metoden, involverer ikke Maxan og Gilbert-sekvensering (eller kjemisk sekvensering, som det også er kjent) hybridiseringsreaksjoner. Metodikken består av merking med reaktive midler i den ene enden, etterfulgt av en renseprosess.

Et av de negative sidene ved denne teknikken ligger i den enorme kompleksiteten og i bruken av kjemikalier som er farlige for brukeren. Kjemiske brudd induseres ved påføring av DMS, maursyre, hydrazin og hydrazin med salter.

Prosess

Protokollen begynner med merkingen i 5'-enden av tråden med fosformarkøren 32, deretter skjer en kjemisk modifisering av nitrogenbasen og den skilles fra hverandre. Endelig skjer spaltningen av abasisk region.

Først forkorter du strengen du vil sekvensere til mindre segmenter. Dette trinnet utføres med restriksjonsenzymer, noe som resulterer i utstikkende ender.

Deretter utføres reaksjonen med en alkalisk fosfatase, hvis formål er å eliminere fosfatgruppen. Således kan en polynukleotidkinase brukes til å utføre merkingen.

Kjeden er denaturert (de to trådene åpnes). Deretter påføres kjemikaliene. Disse spaltningsreaksjonene utføres på en kontrollert måte, og det er kjent hvilke typer bindinger hver påførte kjemikalie bryter.

Leser resultatene

Som i Sanger-metoden involverer avlesningen av resultatene separasjon etter størrelse på kjedene oppnådd i et elektroforesesystem. Systemer sammensatt av polyakrylamid gjør det mulig å oppnå en meget tilstrekkelig oppløsning for å lese gelen.

Massesekvensering

Den massive sekvenseringen omfatter en rekke nye metoder, forkortet NGS, fra den engelske “Next Generation Sequencing”.

Metodene klassifisert som NGS krever et tidligere DNA-amplifiseringstrinn (de fungerer ikke med et enkelt molekyl). Videre varierer plattformene som brukes mye. Prinsippene for de mest populære metodene vil bli beskrevet nedenfor:

pyrosekvensering

Det innebærer å overvåke frigjøringen av et pyrofosfat, som oppstår hver gang et nytt nukleotid tilsettes til DNA-strengen. Et system av enzymer er koblet, slik at utslipp av lys (som kan påvises av et kamera) skjer hver gang et nytt nukleotid blir inkorporert.

Prosessen begynner med den separate inkubasjonen av hver nitrogenbase for å bekrefte om det er lysutslipp eller ikke. Pyrosequencing kan lese lange tråder, men feilfrekvensen som er funnet er høy.

Syntesesekvensering

Dette innebærer inkorporering av merkede nukleotider. Disse fluorescerende komponentene tilsettes, vaskes og det inkorporerte nukleotidet blir notert. Deretter fjernes nukleotidetiketten, og syntesen av tråden kan fortsette. I neste trinn vil også et merket nukleotid bli inkorporert, og de nevnte trinn vil bli gjentatt.

En ulempe med denne teknikken oppstår når lysstoffrørene ikke er helt fjernet. Disse utslippene skaper bakgrunnsfeil, noe som resulterer i betydelige feil.

Sekvensering av ligging

Denne teknikken skiller seg fra de andre, siden den ikke bruker DNA-polymerase. I stedet er nøkkelenzymet for denne metodikken ligase. Her brukes fluorescerende merkede DNA-fragmenter, det kobles sammen av enzymet og det oppdages.

Det største problemet med denne teknikken er den korte fragmentlengden den er i stand til å behandle.

Ion Torrent Sequencing

Denne teknikken er basert på målingen av H ⁺ -ionet som frigjøres hver gang et nytt nukleotid inkorporeres. Prinsippet er ganske likt pyrosekvensering, men mye billigere.

eksempler

Sekvensering av det menneskelige genom

Sekvensering av det menneskelige genom har vært en av de mest lovende utfordringene i biologien, i tillegg til å være en av de mest anerkjente rivaliseringene i vitenskapens historie. For forskerne som var involvert i prosjektet, ble sekvensering av genomet faktisk en konkurranse.

I 1990 startet han det som ble kalt "menneskets genomprosjekt", ledet av den berømte forskeren, nobelprisvinneren, James Watson. Etter et år, i 1991, tar Venter på seg utfordringen med å "slå" Watson og sekvensere genomet foran seg. Imidlertid trakk Watson seg i 1992 og kommandoen ble tatt av en annen forsker.

I 1995 kunngjorde Venter sin suksess i fullstendig sekvensering av et bakteriegenom ved tilfeldig sekvenseringsmetode. Tilsvarende kunngjorde motstanderlaget et år senere sekvensering av gjærgenomet.

I 2000 ble graden avsluttet. Begge selskapene publiserte sine foreløpige hele genomresultater i to av vitenskapens mest prestisjefylte tidsskrifter: Natur og vitenskap.

Imidlertid fortsatte forskere med å forbedre forslagene, og i 2006 ble sekvensene av visse menneskelige kromosomer fullført.

Viktighet og applikasjoner

Å vite rekkefølgen på nukleotidene til et så viktig molekyl som DNA er verdifullt for biologer og relaterte fagpersoner. Denne kjeden av polynukleotider inneholder all nødvendig informasjon for utvikling og vedlikehold av alle livsformer.

Av disse grunnene er kunnskap om denne sekvensen avgjørende for biologisk forskning. I utgangspunktet gjør sekvensering det mulig å måle en av de viktigste egenskapene til biologiske systemer og å etablere forskjeller mellom dem.

Sekvensering er mye brukt av taksonomer og systematikere, siden visse DNA-sekvenser gjør det mulig å etablere kriterier for å konkludere om to organismer tilhører samme art eller ikke, i tillegg til at de kan foreslå hypoteser om fylogenetiske forhold mellom dem.

I tillegg har DNA-sekvensering anvendelser innen medisin og diagnostikk. For eksempel er det billige og tilgjengelige systemer som gjennom sekvensering gjør det mulig å vurdere tendensen til å utvikle visse sykdommer (for eksempel kreft) ved bruk av såkalte single nucleotide polymorfismer (SNP).

Etterforskning av kriminell og rettsmedisinsk type har også blitt beriket med sekvenseringsteknikker, som kan brukes som pålitelige bevis på at en viss person deltar i en forbrytelse.

referanser

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Sekvensen av sequencers: historien om sekvensering av DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Neste generasjons sekvenseringsrevolusjon og dens innvirkning på genomikk. Cell, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Vitenskapelige rivaliseringer. Fra Galileo til det menneskelige genomprosjektet. Redaksjonell Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). DNA-sekvensering med kjedeterminerende hemmere. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Neste generasjons sekvensering transformerer dagens biologi. Naturmetoder, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (red.). (2014). Neste generasjons sekvensering. Caister Academic Press.