OKSIDASETEST: BEGRUNNELSE, PROSEDYRE OG BRUK - BIOLOGI - 2026

Den oksydaseprøve er en diagnostisk metode som viser tilstedeværelsen av enzymkomplekset som kalles cytokromoksydase c. Dette systemet induserer transformasjonen av cytokrom redusert til oksidert, siden det fanger oksygen og dette igjen fungerer som den siste elektronakseptoren (H ⁺ ) i luftveiene.

Begrepet oksydase er en kortfattet måte å referere til enzymet cytokromoksydase, også kjent som indofenoloksydase. I gamle tider ble det antatt at enzymene cytokromoksydase og indofenoloksidase var to forskjellige enzymer, men i dag er de kjent for å være de samme.

Positiv og negativ oksidasetest. Kilde: Ingen maskinlesbar forfatter gitt. Alpha.prim ~ commonswiki antok (basert på krav om opphavsrett).

For deres del er cytokromer hemoproteiner som inneholder jern og fullfører cytokromoksidasesystemet. Cytokromer kan variere fra art til art.

Det er forskjellige varianter av cytokromer (cytokromer a1, a2, a3 og 0). Noen bakterier kan produsere bare en, men andre opptil to eller tre om gangen. I denne forstand er tilstedeværelsen av cytokrom a og a3 kjent som cytokromoksidase c. Dette er den typen cytokrom som oksidasetesten oppdager.

Slektene Neisseria og Pseudomonas inneholder cytokromoksidase c. Disse slektene gir den positive oksidasetesten, og hjelper dem med å skille dem fra henholdsvis Acinetobacter og Stenotrophomonas.

Det er også andre slekter som er oksidase-positive.

Basis

Kjennetegn ved cytokromoksidase-systemet

Systemet cytokrom oksidase c fungerer på følgende måte: oksidase-positive mikroorganismer bruker oksygen for å generere energi gjennom aerob respirasjon. Dette systemet fungerer takket være transport av elektroner fra giverstoffer som NADH ⁺ til reseptorsubstanser, i dette tilfellet oksygen.

Dette resulterer i produksjon av energi (ATP) og vann eller hydrogenperoksyd, avhengig av cytokromoksidasesystemet som mikroorganismen besitter.

Det er grunnen til at de fleste av de oksidase-positive bakteriene også er katalasepositive, en nødvendig betingelse for å eliminere det produserte hydrogenperoksyd, siden dette stoffet er giftig for bakterier.

Systemet cytokrom oksidase er til stede i noen aerobe bakterier, noen fakultative anaerober, få mikroaerofile og ingen strenge anaerober. Det siste er forståelig, siden strenge anaerober ikke kan leve i nærvær av oksygen, derfor mangler de cytokromoksidasesystemet.

Testprinsipp

I denne testen bruker den stoffer som fungerer som kunstige elektronakseptorer, og erstatter naturlige stoffer i elektrontransportkjeden.

Hovedsakelig brukes fargestoffer som parafenylendiamin og indofenol, som fungerer som reseptorsubstrater og kunstige elektrondonorer.

Parafhenylendiamin oksideres av cytokromoksidase c-systemet. Fargestoffet i sin reduserte form er fargeløst, men i oksidert form er det farget.

Dette er hvordan tilstedeværelsen av cytokromoksidase c-systemet er påvist; siden en positiv reaksjon vil generere en lavendel eller blå-lilla farge avhengig av det anvendte reagenset.

På den annen side, hvis det siste elektronaksepterende stoffet i åndedrettskjeden er forskjellig fra oksygen, vil oksidasetesten være negativ (det er ingen fargeproduksjon); dette er tilfelle med anaerobe mikroorganismer.

På samme måte, hvis cytokrom som brukes av mikroorganismen er forskjellig fra cytokromoksidase c, vil det også gi den negative testen.

Prosess

Det er forskjellige reagenser og protokoller for oksidasetesten, alt for samme formål.

reagenser

Kovacs-reagens, Gordon og McLeod-reagens, Nadi-reagens, Carpenter, Suhrland og Morrison-reagens, og bruk av oksidaskiver.

-Kovacs oksidasereagens

Den består av 1% tetrametyl-p-fenylendiamindihydroklorid.

Kovacs reagens fremstilles ved å løse opp 1 g av det ovennevnte stoffet i 50 ml destillert vann. Det blir oppvarmet subtilt til det er helt oppløst. Overfør til en rav flaske med tilstrekkelig kapasitet og fyll opp volumet til 100 ml med destillert vann. Vent minst 15 minutter før du bruker den. Oppbevares i kjøleskap beskyttet mot lys.

Det er merket Kovacs oksidase-reagens for å skille det fra Kovacs-reagenset som ble brukt for å avsløre indol-testen. Dette reagenset er det mest følsomme, mindre giftige, men dyrere enn resten av reagensene.

En positiv reaksjon vil bli påvist med dette reagenset med kolonifargeendringen til lavendel, som raskt blir lilla nesten svart. En negativ reaksjon er tydelig fordi det ikke er noen fargeendring i kolonien, eller den tar på seg en svak rosa farge. Mediet kan også mørkne, men det betyr ikke en positiv reaksjon.

Med dette reagenset er reaksjonstiden avgjørende, en fargeendring som skjer mellom 5 til 15 sekunder, anses som en positiv reaksjon.

-Gordon og McLeod reagens

Det er sammensatt av dimetyl-p-fenylendiamindihydroklorid, også kjent som N-dimetyl-p-fenylendiamin eller p-aminodimetylanilin-monohydroklorid. Det tilberedes som beskrevet for Kovacs oksidasereagens, og erstatter det involverte stoffet.

Dette reagenset er litt mer stabilt enn Kovacs oxidase-reagens, selv om alle reagenser som inneholder p-fenylendiamin er ustabile.

Denne reaksjonen er senere, den tolkes som positiv med utseendet til en blå-lilla farge innen 10 til 30 minutter.

-Nadi reagens

Den består av 1% a-naftol i etylalkohol (95% etanol) og 1% aminodimetylanilin. Blandingen tilberedes i like store deler og bruker absolutt etylalkohol som et fortynningsmiddel, til det er dannet en tilstrekkelig mengde på 100 ml.

-Carpenter, Suhrland og Morrison reagens

Den er sammensatt av 1% p-aminodimetylalaninoksalat. Forbered på samme måte som beskrevet for Kovacs oksidasereagens, og skift for det tilsvarende stoffet.

Når løsningen er klar, blir teststrimlene fremstilt som følger: 6-8 cm Whatman nr. 1 filterpapirstrimler er impregnert med 1% dimetyl-p-fenylendiaminoksalatreagens.

De får tørke uten kontakt med metall, oppbevares i skrukorkede krukker med tørkemiddel og oppbevares i kjøleskap. Disse stripene er stabile i opptil 6 måneder.

Det er det mest stabile reagenset av alle de nevnte, og kan vare i opptil 6 måneder i oppløsning. Et annet plusspoeng er at det ikke farger mediet rundt kolonien, hvis det brukes direkte på tallerkenen.

Utseendet til en rød farge tolkes som en positiv test.

-Oxidase-plater

De er kommersielle skiver som er impregnert med reagens for oksidasetesten. Det er flere kommersielle merker på markedet.

Bruken av den er ganske praktisk, siden det ikke er nødvendig å tilberede ferske reagenser, noe som letter arbeidet. Resultatene som er oppnådd er pålitelige så lenge platene er riktig bevart.

protokoller

Direkte platemetode, indirekte metode på papir og bruk av plater impregnert med oksidasereagenser.

-Direkte tavlemetode

2 eller 3 dråper av hvilke som helst av de nevnte reagenser tilsettes for dette formålet direkte på kolonnen / koloniene som er inneholdt i en plate av kulturmedium som ikke inneholder glukose.

Endringen eller ikke av fargen på koloniene blir tolket, ikke av mediet. Den gyldige reaksjonstiden avhenger av det anvendte reagenset.

-Indirekte metoden på papir

Skjær et stykke filterpapir (Whatman nr. 1) til en størrelse på 6 cm ² og legg det i en tom petriskål.

Tilsett 2 eller 3 dråper Kovacs oxidase-reagens på papiret, ta en del av kolonien som skal studeres med et platinahåndtak eller en tannpirker av tre, og fordel den i en rett linje på reagensimpregnert papir. Tolke innen 5 til 10 sekunder.

Med strimlene tilberedt med Carpenter, Suhrland og Morrison reagens, spres en koloni på den tørre stripen. En enkelt stripe brukes til å teste flere stammer. Tolke på 10 sek.

-Disker (m

Fukt de kommersielle skivene subtilt med sterilt destillert vann og legg over kolonien som skal studeres. Det anbefales å bruke platene ved 35 ° C, hvis plater ved romtemperatur eller kjølte plater brukes, er reaksjonen litt tregere. Tolke fargeendringen mellom 10 til 20 sek.

Kolonier inneholdt på blod eller sjokoladeagar kan brukes.

-Disker (indirekte metode)

Fukt platen som tidligere beskrevet. Legg den i en tom petriskål. Ta en tilstrekkelig mengde av kolonien for å studere med et platinahåndtak eller en tannpirker av tre og legg på disken. Tolke fargeendringen mellom 10 til 20 sek.

Bruk

Slekten Neisseria og Acinetobacter er noen ganger veldig lik morfologisk fordi selv om slekten Acinetobacter er en Gram-negativ stav, kan den noen ganger ta en kokkoid form og distribueres parvis, og simulere slekten Neisseria.

I dette tilfellet er oksidasetesten virkelig nyttig. Neisseria-slekten er positiv og Acinetobacter-negativ.

Slekten Moraxella ligner imidlertid veldig på slekten Neisseria og gir begge en positiv reaksjon; Dette er grunnen til at karbohydratfermenteringstester alltid må utføres for endelig identifisering.

På den annen side er oksidasetesten nyttig for å skille en bakterie som tilhører familien Enterobacteriaceae (alle oksidase-negative) fra andre gjærere, for eksempel slekten Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oksidasepositiv).

Slekten Vibrio og Helicobacter er også oksidasepositive.

QA

Bruk kjente stammer av Escherichia coli som en negativ kontroll og stammer av Pseudomonas aeruginosa som en positiv kontroll.

begrensninger

-Reagensene må brukes nylaget, lagringstiden i løsningen ved romtemperatur er kort fordi de er veldig ustabile. De kan kjøles mellom 5 dager og 2 uker.

-Reagensene er fargeløse, hvis de endrer farge, må de kastes. Skadede plater dukker opp fordi de blir mørke over tid.

-En positiv reaksjon med Kovacs oksidasereagens mellom 15-60 sekunder anses som en forsinket reaksjon, og etter 60 sekunder bør den betraktes som negativ.

-Haemophylus influenzae gir en negativ oksydasereaksjon hvis noe reagens med dimetyl-p-fenylendiamin blir brukt, men positivt hvis Kovacs oksidasereagens (tetrametyl-p-fenylendiamin) blir brukt.

-Medier som inneholder glukose forstyrrer testen og gir falske negativer.

-Bordetella kikhoste stammer kan gi en falsk positiv reaksjon hvis de kommer fra høykonsentrerte blodagarplater.

-Bruk av metall (jern) håndtak gir en falsk positiv reaksjon.

anbefalinger

-Fordi reagensene er veldig ustabile og har en tendens til å selv oksidere, anbefales det å fryse 1 til 2 ml alikvoter og fjerne etter behov.

-En annen måte å utsette auto-oksidasjonen av reagenset på er å tilsette 0,1% askorbinsyre når reagensene tilberedes.

-Som reagensene er ustabile, anbefales det en ukentlig kvalitetskontroll.

-Reagenser som ikke består kvalitetskontrolltesten, skal ikke brukes.

referanser

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
3. "Oxidase Test." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 15. jan 2018, 10:32 UTC. 3. april 2019, 14:03
4. Verdens helseorganisasjon. Laboratoriehåndbok for identifisering og testing av mottakelighet for antimikrobielle stoffer av bakterielle patogener av betydning for folkehelsen i utviklingsland. 2004. Tilgjengelig på: who.int/drugresistance/infosharing
5. Reagensstrimler for diagnostisering av oksidaseaktivitet i bakterier. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.