ZIEHL-NEELSEN FLEKK: BEGRUNNELSE, REAGENSER OG TEKNIKK - BIOLOGI - 2026

Den Ziehl-Neelsen en farging teknikk for å identifisere mikroorganismer resistente alkohol syre (ARA). Navnet på denne mikrobiologiske prosedyren refererer til forfatterne: bakteriolog Franz Ziehl og patolog Friedrich Neelsen.

Denne teknikken er en type forskjellig farging, som innebærer bruk av forskjellige fargestoffer for å skape kontrast mellom strukturene du vil observere, skille og senere identifisere. Ziehl-Neelsen-flekken brukes til å identifisere visse typer mikroorganismer.

Ziehl-Neelsen flekk

Noen av disse organismer er mycobacteria (f.eks. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (f.eks. Nocardia sp.), Og noen encellede parasitter (f.eks. Cryptosporidium parvum). Mange av bakteriene kan klassifiseres gjennom en vanlig teknikk som kalles en Gram-flekk.

Noen bakteriegrupper krever imidlertid andre metoder for å kunne identifisere dem. Teknikker som Ziehl-Neelsen-flekken krever kombinasjoner av fargestoffer med varme for å feste førstnevnte til celleveggen.

Deretter kommer en blekeprosess som gir mulighet for to resultater: motstand eller følsomhet for misfarging av syrer og alkoholer.

Basis

Begrunnelsen for denne fargingsteknikken er basert på egenskapene til celleveggen til disse mikroorganismene. Veggen består av en type fettsyrer som kalles mykolsyrer; Disse er preget av å ha veldig lange kjeder.

Når fettsyrer har veldig lange strukturer, kan de lettere beholde fargestoffer. Noen bakterielle slekter er svært vanskelige å beise av Gram-flekker på grunn av det høye innholdet av mykolsyrer i celleveggen.

Ziehl-Neelsen-flekken bruker fenolforbindelsen carbol fuchsin, en grunnleggende flekk. Dette har evnen til å samhandle med fettsyrene i celleveggen, som er voksaktig i tekstur ved romtemperatur.

Carbol fuchsinfarging forbedres i nærvær av varme, ettersom voksen smelter og fargestoffmolekylene beveger seg raskere inn i celleveggen.

Syren som brukes senere tjener til å misfarge celler som ikke var farget fordi veggen deres ikke var tilstrekkelig relatert til fargestoffet; derfor er styrken til surblekemiddelet i stand til å fjerne syrefargestoffet. Celler som motstår denne misfarging kalles syrefaste.

Sekundær fargestoff

Etter avfarging av prøven blir det kontrast til et annet fargestoff som kalles sekundærfargestoff. Vanligvis brukes metylenblått eller malakittgrønt.

Det sekundære fargestoffet farger bakgrunnsmaterialet og skaper følgelig kontrast til strukturene som ble beiset i det første trinnet. Bare misfargede celler absorberer det andre fargestoffet (forsiktig) og tar på seg fargen, mens syrefaste celler beholder sin røde farge.

Denne prosedyren brukes ofte for å identifisere Mycobacterium tuberculosis og Mycobacterium leprae, som kalles syrehurt baciller.

reagenser

Primær fargestoff

0,3% karbolfuksin (filtrert) brukes. Dette fargestoffet fremstilles fra en blanding av alkoholer: fenol i etanol (90%) eller metanol (95%), og i denne blandingen oppløses 3 gram basisk fuchsin.

Blekeløsning

I dette trinnet kan oppløsninger av 3% alkoholisk syre eller 25% svovelsyre brukes.

Sekundærfargestoff (motfargestoff)

Fargestoffet som brukes mest for å kontrastere prøvene er vanligvis 0,3% metylenblått. Andre kan imidlertid også brukes, for eksempel 0,5% malakittgrønn.

Teknikk

Prosedyre med syrehurt farging

Forbered en bakteriesmurt

Dette preparatet gjøres på et rent, tørt lysbilde etter sterilitetsforholdsregler.

Tørking av smør

La smøret tørke ved romtemperatur.

Varm prøven

Prøven skal varmes opp ved å påføre ild på lysbildet nedenfor. En alkoholfiksering kan gjøres når smøret ikke er tilberedt med sputum (behandlet med natriumhypokloritt for å gjøre det hvitt) og hvis det ikke kommer til å flekker umiddelbart.

M. tuberculosis fjernes med blekemiddel og under farging. Varmefiksering av ubehandlet sputum vil ikke drepe M. tuberculosis, mens alkoholfiksering er bakteriedrepende.

Dekk flekken

Flekken er dekket med carbol fuchsin-løsningen (primær grunnleggende flekk).

Varm opp flekken

Dette gjøres i 5 minutter. Du må merke en evolusjon av damp (ca. 60 ° C). Det er viktig å ikke overopphete og unngå å brenne prøven.

Når det gjelder oppvarming av flekken, må det utvises stor forsiktighet ved oppvarming av carbol-fuchsin, spesielt hvis fargingen utføres på et brett eller annen beholder der svært brennbare kjemikalier fra den forrige farging er blitt samlet.

Bare en liten flamme skal påføres under lysbildene ved bruk av en tidligere opplyst vattpinne fuktet med noen få dråper sur alkohol, metanol eller 70% etanol. Unngå å bruke en stor vattpinne dynket i etanol, da dette er brannfare.

Vask flekken

Denne vasken må gjøres med rent vann. Hvis tappevannet ikke er rent, vask smøringen med filtrert eller destillert vann, helst.

Dekk smøre med sur alkohol

Denne sure alkoholen bør være på 3%. Dekningen utføres i 5 minutter eller til smøringen er tilstrekkelig misfarget, dvs. lyserosa i fargen.

Det må tas i betraktning at sur alkohol er brannfarlig; derfor må den brukes med stor omhu. Unngå å være i nærheten av antennelseskilder.

Vask flekken

Vaskingen skal skje med rent, destillert vann.

Dekk flekken med flekken

Det kan være malakittgrønt (0,5%) eller metylenblått (0,3%) flekker i 1 til 2 minutter, ved bruk av lengre tid hvis utstryningen er tynn.

Vask flekken

Igjen skal rent (destillert) vann brukes.

Å drenere

Baksiden av lysbildet skal rengjøres og flekken plasseres på et dreneringsstativ for å la det lufttørke (ikke bruk absorberende papir for tørking).

Undersøk utstrykningen under mikroskopet

100X objektiv og fordypningsolje må brukes. Skann utstrykningen systematisk og registrer de aktuelle observasjonene.

Tolke resultatene

Teoretisk sett anses mikroorganismer som farger en rødlig farge syrefaste positive (AAR +).

Tvert imot, hvis mikroorganismene farger blått eller grønt, avhengig av fargestoffet som brukes som motfargestoff, blir de ansett som syrehurtige negative (AAR-).

referanser

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1. utg.). Jaypee Brothers Medical Publisher.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologi med sykdommer etter kroppssystem (4. utg.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Innledende mikrobiologi (1. utg.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratory Manual and Workbook in Microbiology: Applications to Patient Care (11. utg.). McGraw-Hill utdanning.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Textbook of Microbiology (1. utg.). BI Publikasjoner PVT.