FOSFATBUFFER (PBS): BEGRUNNELSE, TILBEREDNING OG BRUK - BIOLOGI - 2026

Den fosfatbuffer, fosfatbufret saltvann eller BPS er en buffer isotonisk, hvis funksjon er å opprettholde pH-verdien og det osmotiske trykk som nær den naturlige biologiske miljø (fysiologisk). Forkortelsen PBS står for fosfatbufret saltvann.

PH og osmolaritet er to veldig viktige aspekter som må kontrolleres i visse laboratorieprotokoller. Når det gjelder pH er det viktig at det kontrolleres, spesielt i biokjemiske reaksjoner, siden disse kan variere eller ikke utføres hvis reaktantene har en upassende pH.

PBS fosfatbufret saltløsning ved to forskjellige pH-er. Kilde: Pixinio.com

Imidlertid er kontrollen av osmolaritet viktig, spesielt når du arbeider med levende celler, siden plasmamembranene til cellene reagerer i henhold til konsentrasjonen av løste stoffer de er funnet i.

Hvis cellene overføres til et hypertonisk medium, dehydrerer de, siden vanngradienten vil bli transportert til den siden der det er en høyere konsentrasjon av løste stoffer. Hvis celler tvert imot plasseres i et hypotonisk medium, vil cellene absorbere væske til de er lysert.

Det er grunnen til at PBS-buffer brukes til laboratorieprotokoller som krever vedlikehold av celler in vitro, på denne måten vil ikke cellene bli skadet.

PBS består av en kombinasjon av salter, så som natriumklorid, natriumfosfat, kaliumklorid og kaliumfosfat. Sammensetningen av PBS kan variere avhengig av protokoll.

Basis

I utgangspunktet er fosfatbufferens funksjon å opprettholde en konstant fysiologisk pH sammen med en elektrolyttkonsentrasjon som ligner den som finnes i kroppen.

I dette miljøet er celler i stand til å holde seg stabile, da fysiologiske forhold simuleres så mye som mulig.

Andre forbindelser kan tilsettes den opprinnelige PBS-formuleringen om nødvendig, for eksempel er tilsetning av EDTA til bufferen nyttig for å vaske røde blodceller i tverrkompatibilitetstesten.

EDTA forhindrer at fraksjonen av komplement C1 som er tilstede i serum, blir spaltet og lysert til de røde blodlegemene, det vil si at det forhindrer falske inkompatibilitetsresultater. I tillegg er EDTA med på å dissosiere celler.

Forberedelse

Mengden salter som må veies for fremstilling av PBS fosfatbufret saltvann vil avhenge av mengden som må tilberedes:

-Fosfatbufret saltoppløsningsoppløsning (10X PBS)

For en liter løsning:

Å veie:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Forberedelsesteknikk

Plasser de tunge saltene i et begerglass, tilsett nok vann (80%) og bland på omrøringsplaten med magnetisk stang til saltene er oppløst.

Fremstilling av PBS ved bruk av en omrøringsplate med en magnetisk stang. Kilde: Bruker: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtrer for å fjerne uoppløste partikler. Bruk filtre med porene på 0,45 um. Autoklaver og distribuer aseptisk i en laminær strømningshette i glasskar med lokk.

10X-løsningen (konsentrert) justerer ikke pH. Justeringen gjøres når den er fortynnet til 1X PBS bufferkonsentrasjon (1:10 fortynning).

-Buffer fosfat saltoppløsning (1X PBS)

1X PBS kan fremstilles direkte, veie de tilsvarende mengder av hvert salt, eller det kan fremstilles ved å fortynne stamoppløsningen (1:10) med sterilt destillert vann.

-Til å tilberede direkte en liter 1X PBS fosfatbufret saltvann, veie:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

1,15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g KH ₂ HPO ₄

Forberedelsesteknikk

Fortsett som forklart i den konsentrerte løsningen. Deretter må pH justeres. For å gjøre dette måler du pH og avhengig av resultatet bruker du syre (HCl) eller base (NaOH) for å senke eller heve pH-verdien om nødvendig til den er 7,4.

Syren eller basen tilsettes dråpe for dråpe mens pH-verdien for oppløsningen overvåkes ved bruk av en pH-meter. Filtrer, autoklaver og fordel aseptisk i koniske rør eller glass etter behov.

-For å tilberede 1X PBS fra 10X lagerløsningen:

Gjør en fortynning på 1:10. For å forberede 1 liter 1X PBS, må du for eksempel måle ut 100 ml av stamløsningen og tilsett 700 ml sterilt destillert vann. Juster pH og fyll vannmengden opp til 1000 ml.

Den tilberedte PBS-bufferen er fargeløs og klar.

Daglig PBS kan lagres ved romtemperatur og resten i kjøleskapet.

Løsninger for pH-justering

HCl

For 100 ml 1 molar HCL (saltsyre).

Mål 91 ml destillert vann og legg det i et 250 ml beger.

Mål 8,62 ml konsentrert HC1 og tilfør den sakte i begerglasset som inneholder vannet (gjør det ikke omvendt). Ta passende biosikkerhetsmessige tiltak når du håndterer sterke syrer (sterkt etsende stoff).

Bland i 5 minutter, helst med en røreplate med en magnetisk stang inne i glasset. Overføring til en 100 ml kolbe og fyll opp til 100 ml med destillert H ₂ O.

NaOH

For 100 ml NaOH (natriumhydroksyd) 10 molar.

Mål 40 ml destillert vann og sett det i et 250 ml beger. Mål 40 g NaOH og tilsett i vannet. Bland med en røreplate med en magnetstang inne i glasset.

Overfør til en 100 ml målekolbe og fyll opp til merket med destillert vann. Følg biosikkerhetsforskrifter, fordi denne reaksjonen er eksoterm (den frigjør energi i form av varme).

Hvis du vil tilberede andre mengder fosfat saltoppløsning, kan du se følgende tabell:

Kilde: «Laboratory of Viral and Human Genomics, UASLP School of Medicine»

applikasjoner

Det brukes først og fremst innen cellebiologi, immunologi, immunohistokjemi, bakteriologi, virologi og forskningslaboratorier.

Det er ideelt for cellevask ved sentrifugering (røde blodlegemer), celle monosjikt vasker, i spektroskopiske ellipsometri teknikker, i kvantifisering av bakterielle biofilmer, for å opprettholde cellekulturer for virus, som en vaskeoppløsning i den indirekte immunofluorescens teknikken og i teknikker for karakterisering av monoklonale antistoffer.

Det brukes også til å transportere celler eller vev, som et fortynningsmiddel for celletelling, tilberedning av cellulære enzymer (trypsin), som et fortynningsmiddel for biomolekyltørkingsmetoden og for å fremstille andre reagenser.

På den annen side demonstrerte Martin et al. I 2006 at PBS er nyttig i rettsmedisinske laboratorier, spesielt i utvinning av sæd fra vaginal utstryking, eller i utvinning av vaginalceller fra penissprett. På denne måten kan det fastslås om det har vært et seksuelt forhold.

begrensninger

-Noen PBS-buffere inneholder et stoff som kalles natriumazid som konserveringsmiddel. Denne forbindelsen kan generere eksplosive stoffer hvis den kommer i kontakt med bly eller kobber. Av denne grunn må det tas spesiell forsiktighet når dette reagenset kastes i avløpet. Hvis det kastes på denne måten, må det tilsettes rikelig med vann for å fortynne det så mye som mulig.

-Sink bør ikke tilsettes fosfatbufferen, siden det får noen salter til å felle ut.

-Wangen et al. Bestemte i 2018 at bruken av PBS ikke var egnet til å vaske primære akutte myeloide leukemi (AML) celler ekstrahert fra perifert blod, på grunn av det faktum at mange celler går tapt ved lysis, med stor nedgang i materialet protein.

Derfor bestemte de at primære AML-celler ikke skulle vaskes med PBS etter lagring i flytende nitrogen.

referanser

1. Coll J. (1993). Diagnostiske teknikker i virologi. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Cellekultur. Endring av medium. Institutt for normal og patologisk cytologi og histologi Universitetet i Sevilla. Tilgjengelig på personal.us.es
3. Fremstilling av fosfatbufret saltoppløsning (PBS). (2008). Standard operasjonsprosedyrer (SOPs) Human and Viral Genomics Laboratory UASLP School of Medicine. Tilgjengelig på: genomica.uaslp.mx
4. "Fosfatbuffersalt." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 3 apr 2019, 19:36 UTC. 13. april 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Emner i molekylær biofysikk. Tilgjengelig på: users.df.uba.ar
6. Rediar. Håndbok. PBS + EDTA. Tilgjengelig på: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Bruk av fosfatbufret saltvann for utvinning av celler og sædceller fra vattpinner. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Tilgjengelig på: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, et al. Konserveringsmetode og fosfatbufret saltvask påvirker det akutte myeloide leukemiproteomet. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Tilgjengelig på: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Teoretiske og praktiske grunnlag for histokjemi. Overordnet råd for vitenskapelige undersøkelser. Madrid. Tilgjengelig på: books.google.co.ve