RESTRIKSJONSENZYMER: FUNKSJONER, TYPER OG EKSEMPLER - BIOLOGI

Den restriksjonsenzymer er endonukleaser som benyttes ved visse archaea og bakterier for å hemme eller "begrense" spredningen av virus inne. De er spesielt vanlige i bakterier og er en del av deres forsvarssystem mot fremmed DNA kjent som restriksjons- / modifiseringssystemet.

Disse enzymene katalyserer spaltingen av dobbeltbånd-DNA på spesifikke steder, reproduserbart og uten bruk av ekstra energi. De fleste krever tilstedeværelse av kofaktorer som magnesium eller andre toverdige kationer, selv om noen også krever ATP eller S-adenosylmetionin.

HindIII-reaksjonsskjema for begrensningsenzymer (Kilde: Helixitta via Wikimedia Commons)

Restriksjonsendonukleaser ble oppdaget i 1978 av Daniel Nathans, Arber Werner og Hamilton Smith, som fikk Nobelprisen i medisin for oppdagelsen. Navnet deres stammer vanligvis fra organismen der de først ble observert.

Slike enzymer er mye brukt i utviklingen av DNA-kloningsmetoder og andre molekylærbiologiske og gentekniske strategier. Deres spesifikke sekvensgjenkjenningsegenskaper og evnen til å kutte sekvenser nær gjenkjennelsessteder gjør dem til kraftige verktøy i genetisk eksperimentering.

Fragmenter generert av restriksjonsenzymer som har virket på et bestemt DNA-molekyl, kan brukes til å gjenskape et "kart" av det opprinnelige molekylet ved å bruke informasjon om nettstedene der enzymet kuttet DNA.

Noen restriksjonsenzymer kan ha det samme gjenkjennelsesstedet på DNA, men de kutter ikke nødvendigvis det på samme måte. Dermed er det enzymer som kutter etterlater stumpe ender og enzymer som kutter etterlater sammenhengende ender, som har forskjellige anvendelser innen molekylærbiologi.

For tiden er det hundrevis av forskjellige kommersielt tilgjengelige restriksjonsenzymer, som tilbys av forskjellige kommersielle hus; Disse enzymene fungerer som "tilpassede" molekylsaks for forskjellige formål.

Egenskaper

Restriksjonsenzymer oppfyller den motsatte funksjonen til polymeraser, siden de hydrolyserer eller bryter esterbindingen innenfor fosfodiesterbindingen mellom tilstøtende nukleotider i en nukleotidkjede.

I molekylærbiologi og genteknologi blir de mye brukt verktøy for konstruksjon av ekspresjons- og kloningsvektorer, samt for identifisering av spesifikke sekvenser. De er også nyttige for konstruksjon av rekombinante genomer og har stort bioteknologisk potensiale.

Nylige fremskritt innen genterapi benytter seg av restriksjonsenzymer for introduksjon av bestemte gener i vektorer som er kjøretøyer for transport av slike gener i levende celler, og som sannsynligvis har evnen til å sette inn i det cellulære genomet for å utføre permanente endringer.

Virkningsmekanismen

Restriksjonsenzymer kan katalysere dobbeltbånd-DNA-spaltning, selv om noen er i stand til å gjenkjenne enkeltbånd-DNA-sekvenser og til og med RNA. Skjæring skjer etter gjenkjennelse av sekvensene.

Handlingsmekanismen består av hydrolyse av fosfodiesterbinding mellom en fosfatgruppe og en deoksyribose i skjelettet til hver DNA-streng. Mange av enzymene er i stand til å kutte på samme sted som de kjenner igjen, mens andre kutter mellom 5 og 9 basepar før eller etter det.

Normalt kuttes disse enzymene ved 5'-enden av fosfatgruppen, noe som gir opphav til DNA-fragmenter med en 5 'fosforylend og en 3' terminal hydroksylende.

Siden proteiner ikke kommer i direkte kontakt med gjenkjennelsesstedet i DNA, må de omplasseres suksessivt til det spesifikke stedet er oppnådd, kanskje ved hjelp av "glidende" mekanismer på DNA-strengen.

Under enzymatisk spaltning plasseres fosfodiesterbindingen til hver av DNA-strengene innenfor et av de aktive setene for restriksjonsenzymer. Når enzymet forlater gjenkjennelses- og spaltingsstedet, gjør det det gjennom uspesifikke forbigående assosiasjoner.

typer

Fem typer restriksjonsenzymer er for tiden kjent. Her er en kort beskrivelse av hver enkelt:

Type I-restriksjonsenzymer

Disse enzymene er store pentamerproteiner med tre underenheter, en for restriksjon, en for metylering og en for sekvensgjenkjenning i DNA. Disse endonukleasene er multifunksjonelle proteiner som er i stand til å katalysere restriksjons- og modifikasjonsreaksjoner, de har ATPase-aktivitet og også DNA-topoisomerase.

Enzymer av denne typen var de første endonukleasene som ble oppdaget, de ble først renset på 1960-tallet og har blitt studert i stor dybde siden den gang.

Type I-enzymer brukes ikke mye som et bioteknologisk verktøy, siden spaltingsstedet kan være i en variabel avstand på opptil 1000 basepar fra gjenkjennelsesstedet, noe som gjør dem upålitelige når det gjelder eksperimentell reproduserbarhet.

Type II-restriksjonsenzymer

De er enzymer sammensatt av homodimerer eller tetramere som kutter DNA på definerte steder mellom 4 og 8 bp i lengde. Disse spaltingsstedene er typisk palindromiske, det vil si at de gjenkjenner sekvenser som leses på samme måte i begge retninger.

Mange av type II-restriksjonsenzymene i bakterier kutter DNA når de anerkjenner dens fremmed karakter, siden det ikke har de typiske modifikasjonene som eget DNA skal ha.

Dette er de enkleste restriksjonsenzymene siden de ikke trenger noen andre kofaktorer enn magnesium (Mg +) for å gjenkjenne og kutte DNA-sekvenser.

Presisjonen av type II-restriksjonsenzymer når det gjelder å gjenkjenne og kutte enkle sekvenser i DNA på nøyaktige posisjoner, gjør dem til en av de mest brukte og uunnværlige i de fleste grener av molekylærbiologi.

Innenfor gruppen av II-restriksjonsenzymer er det flere underklasser klassifisert i henhold til visse egenskaper som er unike for hver enkelt. Klassifiseringen av disse enzymene gjøres ved å legge til bokstaver i alfabetet, fra A til Å etter navnet på enzymet.

Noen av underklassene som er mest kjent for sin nytte, er:

Underklasse IIA

De er dimerer av forskjellige underenheter. De gjenkjenner asymmetriske sekvenser og brukes som ideelle forløpere for generering av kutte enzymer.

Underklasse IIB

De består av en eller flere dimerer og kuttet DNA på begge sider av gjenkjennelsessekvensen. De kuttet begge DNA-strengene et basepar-intervall foran gjenkjennelsesstedet.

Underklasse IIC

Enzymer av denne typen er polypeptider med delingsfunksjoner og modifisering av DNA-tråder. Disse enzymene kutter begge strengene asymmetrisk.

Underklasse IIE

Enzymene i denne underklassen er de mest brukte i genteknologi. De har et katalytisk sted og krever generelt en allosterisk effektor. Disse enzymene trenger å samhandle med to kopier av gjenkjennelsessekvensen for å utføre effektiv spaltning. Innenfor denne underklassen er enzymene EcoRII og EcoRI.

Type III restriksjonsenzymer

Endonukleaser av type III-restriksjon er sammensatt av bare to underenheter, den ene er ansvarlig for DNA-gjenkjennelse og modifisering, mens den andre er ansvarlig for sekvensspaltning.

Disse enzymene krever to kofaktorer for deres funksjon: ATP og magnesium. Restriksjonsenzymer av denne typen har to asymmetriske gjenkjennelsessteder, translokaterer DNA på en ATP-avhengig måte og kutter det mellom 20-30 bp ved siden av gjenkjennelsesstedet.

Type IV restriksjonsenzymer

Type IV-enzymer er enkle å identifisere når de kutter DNA med metyleringsmerker, de består av flere forskjellige underenheter som er ansvarlige for å gjenkjenne og kutte DNA-sekvensen. Disse enzymene bruker GTP og divalent magnesium som kofaktorer.

Spesifikke spaltingssteder inkluderer nukleotidstrenger med metylerte eller hydroksymetylerte cytosinrester på en eller begge strenger av nukleinsyrer.

Type V restriksjonsenzymer

Denne klassifiseringen grupperer enzymer av typen CRISPER-Cas, som identifiserer og kutter spesifikke DNA-sekvenser fra invaderende organismer. Cas-enzymer bruker en streng CRISPER-syntetisert guide-RNA for å gjenkjenne og angripe invaderende organismer.

Enzymer klassifisert som type V er polypeptider strukturert etter type I, II og II enzymer. De kan kutte deler av DNAet til nesten hvilken som helst organisme og med et bredt spekter av lengde. Deres fleksibilitet og brukervennlighet gjør disse enzymene til et av de mest brukte verktøyene i genteknologi i dag, sammen med type II-enzymer.

eksempler

Restriksjonsenzymer har blitt brukt for påvisning av DNA-polymorfismer, spesielt i populasjonsgenetiske studier og evolusjonsstudier ved bruk av mitokondriell DNA, for å få informasjon om frekvensene av nukleotidsubstitusjoner.

For tiden har vektorene som brukes for transformasjon av bakterier til forskjellige formål multikloneringssteder der gjenkjennelsessteder for flere restriksjonsenzymer er funnet.

Blant disse enzymene er de mest populære EcoRI, II, III, IV og V, oppnådd og beskrevet for første gang fra E. coli; HindIII fra H. influenzae og BamHI fra B. amyloliquefaciens.

referanser

Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). Biologi mot DNA-begrensning. Microbiologic Reviews, 57 (2), 434–450.
Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR Gir anskaffet motstand mot virus i prokaryoter. Science, 315 (March), 1709–1713.
Goodsell, D. (2002). Det molekylære perspektivet: Restriksjonsendonukleaser. Stamcells Fundamentals of Cancer Medicine, 20, 190–191.
Halford, SE (2001). Hopping, hopping og looping av restriksjonsenzymer. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
Jeltsch, A. (2003). Opprettholdelse av artsidentitet og kontroll av spesiering av bakterier: en ny funksjon for systemer for restriksjon / modifikasjon? Gen, 317, 13-16.
Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewins Gen XII (12 utg.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., … She, Q. (2015). Utnyttelse av type I og Type III CRISPR-Cas systemer for redigering av genom. Nucleic Acids Research, 1–12.
Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Type I-restriksjonsenzymer og deres pårørende. Nucleic Acids Research, 1–25.
Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriksjon Endonukleaser i analyse og restrukturering av DNA-molekyler. Annu. Pastor Biochem. , 273–293.
Nei, M., & Tajima, F. (1981). Dna-polymorfisme påvises ved restriksjon endonukleaser. Genetikk, 145-163.
Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Cellular and Molecular Life Sciences Type II restriksjon endonukleaser: struktur og mekanisme. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
Roberts, R. (2005). Hvordan restriksjonsenzymer ble arbeidshestene til molekylærbiologi. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
Roberts, RJ, & Murray, K. (1976). Restriksjon endonukleaser. Kritiske anmeldelser i biokjemi, (november), 123-164.
Stoddard, BL (2005). Hjemme endonukleasestruktur og funksjon. Kvartalsvise anmeldelser av biofysikk, 1–47.
Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Biologien til begrensning og anti-begrensning Current Opinion in Microbiology, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
Wilson, GG, & Murray, NE (1991). Restriksjons- og modifikasjonssystemer. Annu. Pastor Genet. , 25, 585-627.
Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomisk innsikt i Campylobacter jejuni virulens og populasjonsgenetikk. Infec. Dis. Transl. Med., 2 (3), 109–119.
Yuan, R. (1981). Struktur og mekanisme av multifunksjonelle restriksjoner endonukleaser. Annu. Pastor Biochem. , 50, 285-315.

RESTRIKSJONSENZYMER: FUNKSJONER, TYPER OG EKSEMPLER - BIOLOGI - 2025