CATALASE TEST: BEGRUNNELSE, TEKNIKK OG BRUKSOMRÅDER - BIOLOGI - 2026

Den katalaseprøve er en metodikk som brukes i bakteriologi laboratorier for å avsløre tilstedeværelsen av enzymet katalase i de bakterier som besitter den. Sammen med Gram-flekken er de de viktigste testene som bør utføres på nylig isolerte mikroorganismer. Disse testene veileder mikrobiologen om trinnene som skal følges for den definitive identifikasjonen av den aktuelle mikroorganismen.

Generelt har bakterier som inneholder cytokrom enzymet katalase, noe som betyr at fakultative aerobe og anaerobe bakterier bør ha den. Imidlertid er det unntak, som Streptococcus, som til tross for at de er fakultative anaerobe mikroorganismer, ikke har enzymet katalase.

Å kjøre Catalase Test, viser en positiv reaksjon. Kilde: Ingen maskinlesbar forfatter gitt. Nase antatt (basert på krav om opphavsrett).

Dette er grunnen til at katalasetesten først og fremst brukes til å skille familiene Staphylococaceae og Micrococaceae (begge katalasepositive) fra familien Streptococaceae (katalase negativ).

På samme måte skilles slekten Bacillus (katalasepositiv) fra slekten Clostridium (katalase negativ), blant andre.

Basis

Katalase er et enzym som er klassifisert som et hydroperoxidase, betyr dette at de bruker hydrogenperoksyd (H ₂ O ₂ ) som et substrat .

Det regnes også som en oksydoreduktase, siden det i reaksjonen der den deltar er et element som fungerer som en elektrondonor (reduserende stoff) og et annet som en elektronreseptor (oksiderende stoff).

Catalase er et protein som inneholder en proserisk gruppe med fire trivalente jernatomer (Fe ⁺⁺⁺ ), derfor er det et homoprotein. Ferriionet forblir oksidert under reaksjonen.

Det kan sies at katalase er et avgiftende enzym, da dets funksjon er å eliminere stoffer som produseres under bakteriell metabolisme som er giftige for bakterier. Blant disse stoffene er hydrogenperoksyd.

Hydrogenperoksyd dannes fra nedbrytning av sukker aerobt. Denne prosessen skjer som følger:

Den superoksyd ion (O ₂ ^- ) (frie radikaler) er utformet som sluttproduktet av assimilering av glukose ved den aerobe rute. Dette er giftig og elimineres av enzymet superoksyd-dismutase som omdanner det til gassformig oksygen og hydrogenperoksyd.

Hydrogenperoksyd er også giftig for bakterier og må fjernes. Enzymet katalase nedbryter hydrogenperoksyd i vann og oksygen.

Catalase kan virke på andre underlag enn hydrogenperoksyd, så som alkoholer, aldehyder, syrer, aromatiske aminer og fenoler. Imidlertid kan hydrogenperoksyd også brukes ved katalase for å oksidere andre giftige forbindelser som metyl og etylalkohol.

På samme måte er katalase til stede i fagocytiske celler, og beskytter den mot den giftige virkningen av hydrogenperoksyd.

Rutinemessig teknikk for Catalase Test

-Slide-metode

materialer

3% hydrogenperoksyd (10 volum).

Mikroskop lysbilde

Engangs håndtak av plast eller tannpirker av tre.

Prosess

Ta nok av kolonien for å studere uten å berøre agaren den kom fra. Kolonien må være frisk, det vil si fra en kultur på 18 til 24 timer.

Plasser kolonien på den tørre objektglass og tilsett en dråpe 3% hydrogenperoxyd til det ( 30% H ₂ O ₂ kan også anvendes ). Se øyeblikkelig om det ikke frigjøres bobler.

Tolkning

Positiv reaksjon: evolusjon av gass, beviset ved dannelse av bobler (sterk bobling).

Negativ reaksjon: ingen bobleformasjon.

-Direkte metode i ren kultur

Sted 1 ml av 3% H ₂ O ₂ på en ren plate eller kile kultur som ikke inneholder blod (fortrinnsvis næringsagar). Se om det er bobledannelse umiddelbart eller ikke. 30% H ₂ O ₂ kan også brukes .

Den tolkes på samme måte som porta-objektmetoden.

-Metode med kapillarrør eller Fung and Petrishko

Fyll et 67 mm kapillarrør til en høyde av 20 mm med 3% hydrogenperoksyd etter kapillaritet.

Trykk på isolert koloni som skal studeres sammen med den kapillære fylt med 3% H ₂ O _{2 .} Vær oppmerksom på om kapillæret fylles med bobler på omtrent 10 sekunder. Denne metoden tillater semi-kvantifisering av reaksjonen i kryss:

Uten kryss er det ingen bobler (negativ reaksjon).

+ ---- Få bobler (svak eller forsinket reaksjon).

++ --– Rikelig bobler (moderat reaksjon).

+++ - Bubblene når motsatt ende (sterk reaksjon).

-Taylor og Achanzar-metoden for katalasetester som gir tvilsomhet

Plasser en isolert koloni på en ren, tørr lysbilde, deretter plassere en dråpe av 0,5% H ₂ O ₂ og deksel med et dekkglass. Se om det er dannelse av fangede bobler eller ikke.

Tolkning: tilstedeværelsen av bobler indikerer en positiv reaksjon. Ingen bobler, det tolkes som en negativ reaksjon.

Catalase test for Mycobacterium arter

Denne teknikken må gjøres ved å kontrollere pH og temperatur. Det må utføres under en laminær strømningshette, siden manipulasjonen av de forskjellige Mycobacterium-artene er farlig.

-Materialer

Hydrogenperoksyd 30% eller 110 volum (superoksal).

Fosfatbuffer pH 7

10% mellom 80

Mycobacterium kilekultur i 3 til 4 uker

-Forberedelse

Fosfatbuffer pH 7

Å veie:

1,361 g vannfritt monopotassiumfosfat (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 g vannfri dinatrium (Na2HPO3) fosfat.

Løs opp begge saltene i litt sterilt destillert vann og fyll opp til 1000 ml med vann.

10% mellom 80

Gjør en fortynning av 1:10 til Tween 80 som er kommersielt konsentrert, for å gjøre dette:

Ta 1 ml Tween 80 og legg den i litt destillert vann, oppløs og fyll deretter opp volumet til 10 ml.

Endelig reagens

Bland en mengde fosfatbuffer med en mengde på 10% Tween 80 (like deler). Definer i laboratoriet hvor mye du vil tilberede.

-Prosess

Plasser 5 ml fosfatbuffer i et sterilt skruedekket prøverør (Bakelite).

Ta med nok koloni av en Mycobacterium-vekst frøet i kiler med en inokulasjonssløyfe og løst opp i fosfatbufferen.

Kapp røret uten å stramme gjengen for høyt. Plasser i vannbad ved 68 ° C i 20 til 30 minutter. Ta ut og la avkjøle til 22-25 ° C

Mål 0,5 ml av det endelige reagenset (bland) og tilsett det i røret med den kalde oppløsningen. Se formasjonen eller ikke for bobler.

Det tolkes på samme måte som de tidligere teknikkene.

Bruk

Når kolonivekst oppnås i beriket medium, bør en Gram-flekk og en katalasetest utføres på de oppnådde koloniene. Dette vil veilede mikrobiologen om prosedyrene som skal følges for endelig identifikasjon.

Kilde: Utarbeidet av forfatteren MSc. Marielsa gil

QA

For å evaluere den gode ytelsen til hydrogenperoksydreagenset, bruk ferske dyrkede kontrollstammer, for eksempel Staphylococcus aureus som en positiv kontroll og Streptococcus sp-stammer som en negativ kontroll.

Et annet alternativ som fungerer som en positiv kontroll er å plassere en dråpe hydrogenperoksyd på blodagaren, erytrocyttene har katalase, det vil derfor være en bobling hvis reagenset er i god stand.

En sjokoladeagar kan brukes som en negativ kontroll, her er erytrocyttene allerede lysert og testen er negativ.

begrensninger

-Bruk ikke gamle kulturer for testen, da dette kan føre til falske negativer.

- Unngå å ta kolonier fra kulturer på blodagar, hvis du er forsiktig så du ikke berører agar; Denne prosedyren kan føre til falske positiver, da røde blodlegemer inneholder katalase.

-Hvis du tar kolonien med et platinahåndtak, må du ikke snu rekkefølgen på prosedyren fordi dette kan gi falske positiver. Dette er fordi platina er i stand til å reagere med hydrogenperoksyd og forårsake en bobling.

-Bruk ikke hydrogenperoksydreagenset hvis det er veldig gammelt, da reagenset er veldig ustabilt og har en tendens til å bryte sammen over tid.

-Hold hydrogenperoksydreagensen beskyttet mot lys og nedkjølt for å forhindre skade.

- Utfør en kvalitetskontroll av hydrogenperoksydreagenset hver gang det brukes.

-Ta hensyn til at dersom 30% H ₂ O ₂ blir brukt, de reaksjoner som er sterkere enn de som er foretatt med 3% H ₂ O ₂ .

referanser

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 utg. Redaksjonell Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Biokjemiske tester for identifisering av bakterier av klinisk betydning. 3. utg. Redaksjonell Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. BD Laboratories. Catalase-Gotario Reagent. Tilgjengelig på: http://winklerltda.cl
5. Vadequímica Laboratories. Peroksid. Ekvivalens mellom volum og prosent. Tilgjengelig på: vadequimica.com