BAKTERIELL UTSTRYKING: EGENSKAPER OG PREPARAT - BIOLOGI - 2026

Den bakterielle smøre er en tynn film flekk av en suspensjon av bakterielle mikroorganismer som er laget på en gjennomsiktig glassplate eller slide, for observasjon under et lysmikroskop.

Ekstensjonen i form av en film blir utført for å skille mikroorganismer så mye som mulig, for hvis observasjonen ikke er gruppert, er observasjonen ikke klar.

Figur 1. Bakteriell utstryking sett under et skannende elektronmikroskop. Kilde: pixbay.com

I studien av bakteriekulturer brukes smørepreparat, fiksering og fargingsteknikker for å analysere dem bedre. På grunn av den lille størrelsen på mikroorganismer, er bruk av et optisk mikroskop nødvendigvis nødvendig for deres observasjon.

Optiske mikroskop er essensielle instrumenter for å observere utstryk. Disse bruker optiske linser og lys som gjør det mulig å se prøvene med høy forstørrelse.

Generelt har levende celler stort sett ikke fargede strukturer, sett med lysmikroskopet er de fargeløse, gjennomsiktige prøver, og de viser veldig liten intern kontrast og med omgivelsene.

Observasjon med det enkle lysfeltoptiske mikroskopet, uten bruk av hjelpefargingsteknikker, er svært begrenset og brukes bare i noen tilfeller, for eksempel i observasjonen av bevegelsen av mikroorganismer.

For optimal observasjon av mikroorganismer, må en balanseres mellom kontrast og oppløsning. Celledetaljer kan ikke sees under et mikroskop, selv med høy oppløsning; Bruk av fargestoffer er nødvendig ved fargingsteknikker som gir kontrast for observasjon.

Kjennetegn på bakteriesmurt av god kvalitet

Utmerket kontrast

For å oppnå utmerket kontrast er det sofistikerte mikroskop kalt fasekontrastmikroskop, differensial interferensmikroskop og mørke feltmikroskop. Denne typen mikroskop brukes til å observere bakteriestrukturer som blant annet skjeder og filamenter.

Farging er en enkel teknikk for å øke kontrasten som oppnås med et lysfeltmikroskop. I denne teknikken kan forskjellige flekker brukes, noe som forbedrer mikroskopisk observasjon betydelig.

Flekkene utføres direkte på smørene eller utvidelsene av mikroorganismesuspensjonene på lysbildene, tidligere tørket og fikset.

Bra løsning

Fiksering er en teknikk som brukes til å bevare cellestrukturer; forårsaker inaktivering av mikroorganismer og vedheft til glasset i lysbildet. Det er forskjellige fikseringsbehandlinger: varmefiksering og kjemisk fiksering.

Varmefiksering

Dette er den mest brukte metoden for å observere bakterieutstryk. Teknikken består i å føre bakteriesuspensjonen av smøret gjennom flammen til en lighter. Denne teknikken er i stand til å bevare den eksterne morfologien til bakterier, men ødelegger deres indre strukturer.

Kjemisk fiksering

Kjemisk fiksering bruker konserveringskjemikalier, som formaldehyd eller formalin, etanol og eddiksyre, blant andre. Fordelen med å bruke kjemiske fikseringsmidler er at bevaring av de indre cellulære strukturer i mikroorganismer oppnås.

Figur 2. Blodsmurt. Kilde: Bobjgalindo, fra Wikimedia Commons

God farging

De vanligste prosedyrene for farging av en tidligere tørket og fast smøring er positiv eller enkel farging, forskjellig farging og negativ farging. Det er også spesielle teknikker for farging av bestemte cellestrukturer (kapsel, spore, flagella).

Positiv farging eller enkel farging

Positiv eller enkel farging er den mest brukte smørefargingsteknikken. Den bruker fargestoffer som har muligheten til å binde seg til visse mikrobielle strukturer, slik at de kan observeres under et mikroskop.

Disse fargestoffene har kromoforegrupper (farget del) i sin kjemiske struktur, med vekslende dobbeltbindinger og enkeltbindinger (konjugering). Disse bindingene kan igjen etablere ioniske eller kovalente bindinger med noen cellulære strukturer.

Fargestoffene som brukes ved positiv eller enkel farging er stort sett kjemiske derivater av anilin (fargede organiske salter).

På den annen side kan vi blant fargestoffene finne noen med en grunnleggende pH og andre med en sur pH.

Grunnfarger

Ved basiske fargestoffer har kromoforegruppen en positiv elektrisk ladning. De aller fleste prokaryote mikroorganismer har en nøytral indre pH, og deres celleoverflate er negativt ladet. Gjennom dette elektrostatiske samspillet binder kromoforen seg til cellen og flekker den.

Eksempler på basiske fargestoffer er metylenblått, krystallfiolett, malakittgrønt, basisk fuscin, safranin, blant andre.

Syrefargestoffer

I syrefargestoffer har kromoforegruppen en negativ elektrisk ladning. Disse brukes til å farge proteiner med positivt ladede aminogrupper. Eksempler på syrefargestoffer er sur fuscin, rose Bengal, Kongo rød og eosin.

Differensiell farging

Differensialfargingsteknikken består av å påføre to fargestoffer med ulik farge eller intensitet, for å skille forskjellige mikroorganismer under mikroskopet. Gram-flekken og syre-alkoholresistens-flekken er de mest brukte differensialfargene i bakteriologi.

Gram-flekken brukes som en foreløpig test for å kjenne til form, størrelse, cellegruppe, samt type cellevegg. Ved bruk av Gram-flekketesten klassifiseres celleveggbakterier til Gram-positive bakterier og Gram-negative bakterier.

Negativ farging

I denne teknikken brukes kjemiske fargestoffer som ikke trenger inn i det indre av cellen, men gjør at mediet der mikroorganismene er, fremstår som en svart bakgrunn.

I den negative fargingsteknikken er smøret laget av en dråpe India blekk- eller nigrosinsuspensjon, som etter å ha tørket ved romtemperatur danner en ugjennomsiktig film til lysets gang. På denne måten vises mikroorganismer som lyse former på en mørk bakgrunn.

Forberedelse

A. Smøre

1.- Vask lysbildene veldig godt, tørk med absorberende papir og merk dem. Etiketten må angi innholdet i preparatet, datoen og navnet på personen som behandlet det.

2.- Tenn lettere og steriliser inokulasjonssløyfen i flammen til den er lys rød.

3.- La håndtaket avkjøles.

4.- Ta bakteriekulturrøret, fjern hetten og passer raskt munnen på røret nær brennerflammen (flammen).

5.- Sett inokulasjonssløyfen i røret som inneholder bakteriekulturen, og ta prøven.

6.- Hvis kulturen er i flytende medium, plasser prøven tatt med håndtaket i midten av lysbildet og spre den forsiktig i en sirkel med en diameter på omtrent 2 cm.

7.- Steriliser inokulasjonssløyfen igjen.

8.- La smøret tørke i luften.

9.- Gjenta trinn 3 til 8 tre ganger.

10.- Hvis kulturen er i fast medium, må en dråpe destillert vann tidligere plasseres på lysbildet. Dette gjøres for å blande en liten prøve av kulturen tatt med inokulasjonssløyfen, som anvist i trinn 2 til 5 (aseptiske forhold).

11.- Fordel den fortynnede prøven med vanndråpen på lysbildet og gjenta tre ganger.

B. Fiksering

1.- Tilsett to dråper metanol eller absolutt etanol til det tørre utstryket - fra kulturer i flytende medium -.

2.- La lufttørking bort fra lighteren.

3.- Hvis smøret kommer fra en kultur på fast medium, fikseres det tørre smøret med varme, og fører det 2 til 3 ganger raskt gjennom den varmeste delen av den lysere flammen.

4.- Berør den nedre delen av smøret med ryggdelen av venstre hånd (for høyrehendere; bruk ellers høyre side) og kontroller at det er kaldt.

C. Enkel farging

1.- Tilsett 2 dråper av den valgte flekken til smøringen og la den virke i den nødvendige tiden i de spesifikke protokollene for hver flekk (vanligvis mellom 1 og 5 minutter).

2.- Noen flekker krever bruk av varme for aktivering av dem. I så fall er det nødvendig å være veldig forsiktig når du oppvarmer lysbildet i den lysere flammen (manipulere den med pinsett og unngå å koke). Overoppheting av utstryk kan ødelegge cellene som skal observeres.

3.- Fjern overflødig fargestoff ved å vaske med destillert vann fra en pikette. Fjern vaskevannet ved å banke forsiktig på gliden på kanten, vippet på arbeidsbordet.

4.- La lufttørking.

5.- Avhengig av observasjonstype, brukes et dekkglass eller ikke på dette stadiet. Dekkslippen beskytter og bevarer utstryningen. Hvis det blir gjort en observasjon av nedsenkning av oljen på dette stadiet, brukes ingen dekkglass, men utstrykningen kan ikke bevares.

D. Definitiv konservering av utstryningen

1.- Senk smøret suksessivt i hver av løsningene som er angitt nedenfor, i minimum 5 minutter. Hensikten med disse "badene" er å dehydrere smøret fullstendig. Hvert reagens skal tappes grundig før smør innføres i neste bad.

Rekkefølgen på dehydratiserende badene er som følger:

1. Etanol 70%
2. Etanol 95%
3. Ren aceton
4. Aceton-xylol 1: 1-blanding
5. xylen

La deretter lufttørke.

2.- Monter dekkglippen, fortrinnsvis 22 × 22 mm, ved bruk av Canada balsam eller annet monteringsmedium.

referanser

1. Briggs, G. (1965). Årsaksfaktorer ved mikrobiologiske laboratorieulykker og infeksjoner. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG og Welch, CT (2017). Mikrobiologi: En laboratoriehåndbok. Pearson.
3. Holt, JG Editor. (1977). Den kortere Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8 ^th Baltimore: The Williams og Wilkins Co.
4. Johnson, TR og Case; CL (2018). Laboratorieeksperimenter i mikrobiologi. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostisk mikrobiologi. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.