DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENYLINDOL): EGENSKAPER, BEGRUNNELSE, BRUK - KJEMI - 2025

Den DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindol) er et fargestoff med fluorescerende egenskapen tjener som en markør, mye brukt i faget av fluorescens mikroskopi eller flowcytometri, blant andre. Fluorescensen den avgir er lyseblå, dens eksitasjon skjer mellom 455-461 nm (UV-lys).

DAPI-fargestoff kan passere gjennom cellemembranen til døde celler med stor letthet. Det kan også beise kjernene i levende celler, men i dette tilfellet må konsentrasjonen av dette være høyere.

Kjemisk struktur av det fluorescerende fargestoffet DAPI. Kilde: Bilde: File: DAPI.svg er en vektorversjon av denne filen. Det skal brukes i stedet for dette rasterbildet når det ikke er dårligere / Richard Wheeler (Zephyris) Redigert bilde

Fargestoffet er i stand til å få tilgang til cellulært DNA som det har en spesiell affinitet, og binder med stor aviditet til nitrogenholdige baser adenin og timin. Av denne grunn er det veldig nyttig i noen molekylærbiologiteknikker.

Denne forbindelsen tilhører gruppen indolfargestoffer og har vist seg å ha større følsomhet for DNA enn etidiumbromid og propidiumjodid, spesielt på agarosegeler.

Bruken av dette fluorescerende fargestoffet er veldig bredt, da det er nyttig for: å studere endringer i DNA i apoptotiske prosesser (celledød) og derfor å oppdage celler i denne prosessen; for fotografering av DNA-fotografering (DNA-fotoutskrift); å studere bakteriell forurensning; eller å visualisere kjernefysisk segmentering.

Det har også blitt brukt i studien av kromosomale bånd, i påvisning av Mycoplasmas sp DNA, i DNA-protein-interaksjonen, i farging og telling av celler ved immunfluorescens og til og med for å farge modne pollenkorn.

kjennetegn

DAPI er forkortelsen for det kjemiske navnet (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Dens molekylformel er C ₁₆ H ₁₅ N _5. Den har en molekylvekt på 350,3. I nærheten av UV-lysområdet (345 til 358 nm) skjer den maksimale eksitasjonen av DAPI-DNA-komplekset, mens den maksimale fluorescensutslipp skjer mellom 455-461 nm.

Dette fargestoffet er karakterisert som et gult pulver, men strukturer merket med denne fluoroforen avgir et strålende blått lys.

Det er en forbindelse som er løselig i vann, men for å akselerere oppløsningen kan det tilføres varme. Det kan fortynnes med PBS, men ikke direkte oppløses i det.

Når fargestoffet er tilberedt, må det oppbevares i mørket, det vil si beskyttet mot lys, ved en temperatur på 2 til 8 ° C (kjøleskap). Under disse forholdene er fargestoffet stabilt i mer enn 3 uker eller måneder.

Hvis den er beskyttet mot lys, men blir liggende ved romtemperatur, synker stabiliteten til 2 eller 3 uker, men utsatt for direkte lys er forverringen veldig rask. Hvis du vil lagre mye lenger, kan den kjøles ved -20 ° C fordelt på alikvoter.

Basis

Denne fargingen er basert på å generere et kjernefysisk forsinn i de viktigste molekylærbiologiske teknikkene, for eksempel: flytcytometri, fluorescensmikroskopi og farging av metafasekromosomer eller mellomfasekjerner.

Denne teknikken er basert på den store affiniteten som fargestoffet har for nitrogenholdige baser (adenin og timmin) som er inneholdt i arvestoffet (DNA) i mindre spor. Mens det på cytoplasmatisk nivå etterlater det veldig liten bakgrunn.

Når det fluorescerende fargestoffet binder seg til adenin- og timminregionene til DNA, øker fluorescensen betydelig (20 ganger mer). Fargen den avgir er lys blå. Det er spesielt ingen fluorescensutslipp når det bindes til GC (guanin-cytosin) basepar.

Det er viktig å merke seg at selv om det også har en tilhørighet for RNA, forårsaker dette ikke noe problem, fordi den høyeste grad av energiutslipp fra dette molekylet skjer på en annen bølgelengde (500 nm), i motsetning til DNA, som gjør det ved 460 nm. Videre er økningen i fluorescens når den er bundet til RNA bare 20%.

DAPI brukes mer til å beise døde (faste) celler enn levende celler, siden det er nødvendig med en mye høyere konsentrasjon av fargestoffet for å beise sistnevnte, dette er fordi cellemembranen er mye mindre gjennomtrengelig for DAPI når den er i live.

DAPI-fargestoff kan brukes i kombinasjon med røde og grønne fluoroforer for en opplevelse i flere farger.

Bruk

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) er en utmerket fluorofor og er derfor mye brukt i forskjellige teknikker og til forskjellige formål. Følgende forklarer bruken av DAPI i hovedteknikkene.

Flowcytometri

Forskerne Gohde, Schumann og Zante i 1978 var de første som brukte og foreslo DAPI som en fluorofor i flowcytometri-teknikken, og hadde stor suksess på grunn av sin høye følsomhet for DNA og dens høye intensitet i fluorescensutslipp.

Bruken av DAPI i denne teknikken gjør det mulig å studere cellesyklus, kvantifisering av celler og farging av levende og døde celler.

Selv om det er andre fargestoffer, så som etidiumbromid, Hoechst-oksid, akridinoransje og propidiumjodid, er DAPI en av de mest brukte, ettersom den er mer fotostabil enn de som tidligere er nevnt.

For denne teknikken er det nødvendig å fikse cellene, for dette kan absolutt etanol eller 4% paraformaldehyd brukes. Prøven sentrifugeres og supernatanten kastes, deretter hydreres cellene ved tilsetning av 5 ml PBS-buffer i 15 minutter.

Mens tiden går forbereder DAPI-flekken med en fargebuffer (FOXP3 fra BioLegend) i en konsentrasjon på 3 uM.

Sentrifuger prøven, kast supernatanten og dekk deretter med 1 ml DAPI-løsning i 15 minutter ved romtemperatur.

Ta prøven til flowcytometeret med riktig laser.

Flow Microfluorometry

En annen teknikk der DAPI brukes er i strømningsmikrofluorometri sammen med en annen fluorofor kalt mithramycin. Begge er nyttige for å kvantifisere kloroplast-DNA individuelt, men DAPI er best egnet for å måle T4-bakteriofagpartikler.

hybridisering

Denne teknikken bruker i utgangspunktet DNA-prober merket med et lysstofffargestoff som kan være DAPI.

Prøven krever varmebehandling for å denaturere dobbeltstrenget DNA og omdanne det til to enkeltstrengede tråder. Deretter hybridiseres den med en DAPI-merket denaturert DNA-sonde som har en sekvens av interesse.

Senere vaskes den for å eliminere det som ikke ble hybridisert, en kontrast brukes til å visualisere DNA. Fluorescensmikroskopet tillater observasjon av den hybridiserte sonden.

Denne teknikken har som formål å oppdage spesifikke sekvenser i kromosomalt DNA og være i stand til å stille diagnosen visse sykdommer.

Disse cytomolekylære teknikkene har vært til stor hjelp for å bestemme detaljer i studien av karyotyper. For eksempel har han vist de basepar-rike regionene av adenosin og timmin kalt heterokromatiske regioner eller DAPI-bånd.

Denne teknikken er mye brukt for å studere kromosomer og kromatin i planter og dyr, så vel som for diagnostisering av prenatal og hematologisk patologi hos mennesker.

I denne teknikken er den anbefalte DAPI-konsentrasjonen 150 ng / ml i en periode på 15 minutter.

Samlede lysbilder skal oppbevares beskyttet mot lys ved 2-8 ° C.

Immunofluorescensfarging

Cellene er fikset med 4% paraformaldehyd. Hvis andre flekker skal brukes, blir DAPI igjen på slutten som et understrøk, og cellene blir dekket med PBS-løsning i 15 minutter. Mens tiden går, forbered DAPI-løsningen ved å fortynne med PBS, slik at sluttkonsentrasjonen er 300 uM.

Deretter fjernes overflødig PBS og tildekkes med DAPI i 5 minutter. Vaskes flere ganger. Lysbildet blir sett under et fluorescensmikroskop under det aktuelle filteret.

Sikkerhetsark

Denne forbindelsen må håndteres med forsiktighet, fordi det er en forbindelse som har mutagene egenskaper. Aktivert karbon brukes til å eliminere denne forbindelsen fra vandige oppløsninger som skal kasseres.

Hansker, kappe og vernebriller må brukes for å unngå ulykker med dette reagenset. Hvis det oppstår kontakt med hud eller slimhinner, bør området vaskes med nok vann.

Du bør aldri pipette dette reagenset gjennom munnen, bruk pipetter.

Ikke forurenser reagenset med mikrobielle midler, da dette vil føre til feilaktige resultater.

Ikke fortynn DAPI-flekken mer enn anbefalt, da det vil redusere kvaliteten på flekken betydelig.

Ikke utsett reagenset for direkte lys, eller hold det varmt, da dette reduserer fluorescensen.

referanser

1. Brammer S, Toniazzo C og Poersch L. Corantes ofte involvert i plantecytogenetikk. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Tilgjengelig fra: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Tilgjengelig på: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. Instruksjoner for bruk av DAPI. tilgjengelig på cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Konsepter og teknikker innen elveøkologi. (2009). Redaksjonell Rubes, Spania. Tilgjengelig på: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Bruk av fluorescens i en modifisert dissektormetode for å estimere antall myocytter i hjertevev. Arch. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Tilgjengelig fra: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Tilstedeværelse av fytoplasmer i papaya (Carica papaya) i Mexico. Chapingo Magazine. Hagebrukserie, 2011; 17 (1), 47-50. Tilgjengelig på: scielo.org.