IMMUNFLUORESCENS: BEGRUNNELSE, PROTOKOLL OG APPLIKASJONER - BIOLOGI - 2026

Den immunfluorescens er en kraftfull teknikk immunfarging ved anvendelse av antistoffer kovalent bundet til fluorescerende molekyler for å identifisere spesifikke mål i celleprøver festet på en fast bærer.

Denne teknikken innebærer mikroskopisk observasjon med immunologisk spesifisitet, noe som gjør det mulig å observere levende eller døde celler som kan presentere minusule mengder antigener. Det er mye brukt både innen forskningsfelt og i klinisk diagnose av forskjellige patologier.

Immunolabeling av aktinfilamenter i kardiomyocyttceller (Kilde: Ps1415 via Wikimedia Commons)

Denne teknikken, hovedsakelig kvalitativ (med noen kvantitative varianter), har spesielt å gjøre med visualiseringen av en prøve med produktsignalet til en fluorofor, som er et lysstoffmolekyl bundet til et antistoff og som er i stand til å bli eksitert ved en viss bølgelengde .

I cellulær sammenheng er det veldig nyttig å studere tilstedeværelse / fravær og subcellulær lokalisering av proteiner. Teknikken ble opprinnelig brukt i kliniske omgivelser for diagnostisering av virus som influensa og deretter for mange andre smittsomme sykdommer.

Det er en svært følsom teknikk, og med passende mikroskopiutstyr kan det ha veldig god oppløsning. Det krever, for sin observasjon, bruk av konfokale eller epifluorescensmikroskop.

Til tross for at den er veldig populær, kan den imidlertid by på noen viktige problemer med hensyn til å oppnå uspesifikk fluorescens som genererer litt bakgrunnsstøy, noe som ofte begrenser tilstrekkelig lesing av resultatene.

Basis

Immunfluorescens er basert på utnyttelse av det biologiske fenomenet av interaksjonsreaksjonen mellom et antistoff og et antigen. Det har å gjøre spesifikt med visualisering eller påvisning av denne reaksjonen med spennende fluorescerende molekyler til en spesifikk bølgelengde.

Et antistoff er et immunoglobulinprotein som skilles ut fra aktive B-celler, som er spesifikt generert mot et antigen, som det kan binde til med høy affinitet og spesifisitet. Immunfluorescens benytter seg av IgG-immunglobuliner, som finnes løselig i blodserum.

Antistoffer er molekyler opp til 950 kDa som består av to korte (lette) og to lange "Y" -formede (tunge) peptidkjeder. Både de lette og tunge kjedene er delt inn i to domener: den ene variabelen, som er i stand til å gjenkjenne antigenet, og den andre konstant eller bevart, karakteristisk for hver art.

Antigener er funksjonelt definert som molekyler som kan gjenkjennes av et antistoff og er for det meste proteiner. Når et dyr blir utsatt for et antigen, aktiveres lymfocyttene i immunsystemet, og produserer spesifikke antistoffer mot det og som fungerer som et forsvarssystem.

Et antigen, så som et protein, for eksempel, kan ha mer enn en epitop eller et sted for gjenkjennelse av et antistoff, og serumet til dyret som er utsatt for et antigen kan således ha polyklonale antistoffer mot forskjellige regioner av det samme proteinet.

Immunfluorescens utnytter deretter et dyrs evne til å produsere polyklonale antistoffer mot et spesifikt antigen for å rense det og deretter bruke det til påvisning av det samme antigenet i andre sammenhenger.

Blant fluorescerende fargestoffer eller molekyler som er mest brukt for noen immunofluorescens-teknikker, er fluoresceinisothiocyanat (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate-5 og 6 (TRITC), mange cyaniner som Cy2, Cy3, Cy5 og Cy7 og fargestoffer kalt Alexa Fluor® , som Alexa Fluor®448.

protokoll

Immunfluorescensprotokollen varierer avhengig av mange faktorer, men generelt sett omfatter den en lineær sekvens av trinn som består av:

• Forberedelse av platene og cellene
• Fiksering av prøver
• permeabilization
• blokkering
• Immunfarging eller immunfarging
• Montering og observasjon

-Forberedelse

Av prøvene

Utarbeidelsen av prøvene vil avhenge av deres art og typen erfaring som skal utføres. Det enkleste tilfellet, som involverer bruk av celler i suspensjon, vil bli forklart nedenfor.

Celler i suspensjon, det vil si i et flytende dyrkningsmedium, må først skilles fra det ved sentrifugering og deretter må vaskes med en bufferløsning eller isosmotisk "buffer", som bevarer deres integritet.

Normalt brukes en fosfat-saltvannsbuffer kjent som PBS, der cellene blir resuspendert og denne blandingen blir sentrifugert igjen for å oppnå celler som er fri for kulturmediet, som kan inneholde forstyrrende stoffer.

Av bladene

Objektglassene som brukes til mikroskopisk observasjon, der cellene senere vil bli fikset for de tilsvarende nedstrømsbehandlingene, må også utarbeides nøye.

Disse blir dekket eller "sensibilisert" med en løsning av poly-lysin, en syntetisk polymer som vil fungere som et "molekylært lim" mellom cellene og den faste bæreren, takket være den elektrostatiske samspillet mellom de positive ladningene til deres aminogrupper og negative ladninger på proteinene som belegger celler.

Fiksering av prøver

Denne prosessen består i å immobilisere proteiner som finnes inne i cellen for å holde deres romlige beliggenhet intakt. Molekylene som brukes må være i stand til å krysse alle typer cellemembraner og danne gitter med de kovalente proteiner.

Formaldehyd og paraformaldehyd, glutaraldehyd og til og med metanol er mye brukt, som celleprøver inkuberes i en viss tid og deretter vaskes med en isosmotisk bufferløsning.

Etter å ha fikset cellene fortsetter de å være festet til arkene som tidligere var sensibiliserte med poly-lysin.

permeabilization

Avhengig av type test som blir utført, vil det være nødvendig å permeabilisere cellene som er undersøkt eller ikke. Hvis det som blir søkt er å vite plasseringen, tilstedeværelsen eller fraværet av et visst protein på celleoverflaten, vil permeabilisering ikke være nødvendig.

På den annen side, hvis du vil vite plasseringen av et protein inne i cellen, er permeabilisering essensiell og vil bestå av å inkubere prøvene med Triton X-100, et vaskemiddel som kan permeabilisere cellemembraner.

blokkering

Et grunnleggende trinn i alle immunologiske teknikker er blokkering. På dette stadiet av prosedyren består blokkering av å dekke på de sensibiliserte ark alle setene med poly-lysinmolekyler som cellene ikke fester seg til. Det vil si at det forhindrer enhver uspesifikk forening.

Normalt brukes oppløsninger med bovint serumalbumin (BSA) i PBS-buffer for blokkering, og de beste resultatene oppnås jo lenger inkubasjonstid med denne løsningen er. Etter hvert trinn, inkludert blokkering, er det nødvendig å vaske av den gjenværende løsningen.

Immunfarging eller immunfarging

Prosedyren for immunfarging eller immunfarging vil hovedsakelig avhenge av om det er en direkte eller indirekte immunfluorescens (se nedenfor).

Hvis det er en primær eller direkte immunofluorescens, vil prøvene bli inkubert med de ønskede antistoffene, som må kobles til de fluorescerende fargestoffene. Inkubasjonsprosedyren består i å lage en fortynning av antistoffet i en løsning som også vil inneholde BSA, men i en lavere andel.

Når saken dreier seg om sekundær eller indirekte immunfluorescens, skal to påfølgende inkubasjoner utføres. Først med de ønskede antistoffene og deretter med antistoffene som er i stand til å påvise de konstante regionene til de primære immunoglobuliner. Det er disse sekundære antistoffene som er kovalent bundet til fluoroforer.

Teknikken er veldig allsidig, og tillater samtidig merking av mer enn ett antigen per prøve, så lenge det er primære antistoffer koblet til forskjellige fluoroforer, i tilfelle av direkte immunofluorescens.

For samtidig merking i indirekte immunofluorescens er det nødvendig å sikre at hvert primært antistoff produseres i et annet dyr, så vel som at hvert sekundært antistoff er koblet til en annen fluorofor.

Som blokkering gir inkubering med antistoffer bedre resultater jo lenger tid på dette. Etter hvert trinn er det nødvendig å vaske bort overflødig antistoff som ikke binder seg til prøvene, og i den sekundære immunfluorescensen er det nødvendig å blokkere før du tilsetter det sekundære antistoffet.

Enkelte teknikker bruker andre flekker som ikke er relatert til immunfarging, for eksempel farging av kjernefysisk DNA med DAPI-fluorofor.

Montering og observasjon

I løpet av den endelige inkubasjonstiden med fluoroforene er det nødvendig at prøvene blir liggende i mørket. For observasjon under mikroskop er det vanlig å bruke noen stoffer for å bevare fluorescensen til fluoroforene koblet til antistoffene.

typer

Grafisk sammendrag av direkte og indirekte immunfluorescens (Kilde: Westhayl618 via Wikimedia Commons)

Direkte eller primær immunfluorescens

Det har å gjøre med påvisning av antigener ved bruk av lysstoff antistoffer. Den største fordelen ved å bruke denne teknikken er dens hastighet. Imidlertid kan mange tilfeller av uspesifikk binding forekomme i prosessen, spesielt når du studerer humane sera, ettersom de er rike på sterkt heterogene antistoffer.

Indirekte eller sekundære immunfluorescenser

Det er også kjent som "sandwich" -teknikken, og dette innebærer utvikling av teknikken i to trinn. Det første har å gjøre med bruken av et ikke-fluoriserende antistoff og dets binding til antigenet av interesse.

Mot den konstante regionen av dette første antistoffet (som nå vil tjene som et antigen) brukes et andre antistoff som er i stand til å gjenkjenne det, som er assosiert med et lysstoffrør.

Utseendet til et fluorescerende signal vil være et resultat av spesifikk gjenkjennelse mellom det første ikke-fluorescerende antistoffet og antigenet av interesse; tilstedeværelsen av dette første antistoffet konditionerer det for det andre, som er merket og takket være hvilket nærvær eller fravær av antigenet kan bestemmes.

Til tross for at det er en mye mer tidkrevende teknikk enn direkte immunofluorescens (siden den inkluderer et ytterligere inkubasjonstrinn), innebærer denne teknikken ikke utformingen av et lysstoffantistoff for hvert antigen som blir studert, noe som resulterer i økonomiske termer, mer levedyktig.

Videre er det en mer følsom teknikk når det gjelder signalforsterkning, siden mer enn ett sekundært antistoff kan binde seg til det konstante området av det primære antistoffet, og dermed forsterke intensiteten til det fluorescerende signalet.

applikasjoner

Som tidligere nevnt, er immunfluorescens en ekstrem allsidig teknikk som har blitt brukt på mange måter innen det vitenskapelige og kliniske området. Det kan brukes til å svare på økologiske, genetiske og fysiologiske spørsmål angående mange organismer.

Blant de kliniske anvendelsene brukes den til direkte diagnose av noen dermatologiske sykdommer, enten ved bruk av direkte eller indirekte immunofluorescens på epitelvev hos de undersøkte pasientene.

Immunfluorescens-teknikker har vært tilgjengelige i encellede organismer som gjær for å visualisere intranukleære og cytoplasmatiske mikrotubuli, actin og tilknyttede proteiner, 10 nm filamenter og andre bestanddeler av cytoplasma, membran og cellevegger.

referanser

1. Abcam, immunocytochemistry og immunofluorescence protokoll. Hentet fra abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescerende fargestoffer. Hentet fra leica-microsystems.com
3. Miller, DM, & Shakest, DC (1995). Immunofluorescensmikroskopi. I Methods in Cell Biology (Vol. 48, s. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Immunofluorescence teknikker. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Immunfluorescensmetoder for gjær. I Methods of Enzymology (Vol. 194, s. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Anvendelser av immunfluorescens i folkehelsevirologi. Bakteriologiske anmeldelser, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). Immunofluorescens i planteplanktonforskning: applikasjoner og potensial. J: Phycol. , 32, 1–16.